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¿Qué medios y caldos usar?

RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS

1.  Agar Plate Count

2.  Agar Blanco

RECUENTO DE BACTERIAS PSICROTROFAS

1.  Agar plate count 

RECUENTO DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS

1. Agar Mann-Rogosa-Sharpe (MRS)

RECUENTO DE BACTERIAS LIPOLÍTICAS

1. Agar Noble 

2. Agar tributirina. 

RECUENTO DE BACTERIAS PROTEOLÍTICAS

1. Agar Skim milk

RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS

1. Agar Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura (OGY)

2. Agar extracto de levaduraglucosa-cloranfenicol (YPG) 

3. Agar Rosa de Bengala-cloranfenicol

RECUENTO MICROORGANISMOS OSMOFÍLICOS 

1. Agar MY 40

RECUENTO DE Enterobacteriaceae SIN REVIVIFICACIÓN

1. Medio cristal violeta-bilis-glucosa (VRBG) 

2. Agar tripticasa de soya  

3. Agar nutritivo Agar glucosado (AG)

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES

1.  Medio cristal violeta-bilis-lactosa (VRB)

RECUENTO DE Escherichia coli / RECUENTO DE Escherichia coli, filtración por membrana 

1. Agar chromocult 

PRUEBA DE AUSENCIA/PRESENCIA DE Salmonella spp.

1. Agar Hecktoen, XLT4, Sulfito Bismuto 

2. Caldo Rappaport-Vassiliadis, caldo tetrationato 

3. Caldo Urea

4.  Agar LIA 

5. SIM 

6. Agar nutritivo 

PRUEBA DE AUSENCIA/PRESENCIA DE Salmonella spp. Método alterno

1. Agar Rambach 

2. Caldo y pastilla Salmosyst 

3. API Salmonella spp

RECUENTO DE Clostridium sulfito reductor

1. Agar Triptona-Sulfito neomicina (TSN) 

2. Medio tioglicolato 

3. Medios nitritos-movilidad

4. Medio gelatina lactosa. 

RECUENTO DE ENTEROCOCCUS 

1. Medio Canamicina-Esculina-Azida 

2. Tubo con agar BHI, Caldo BHI pH 9.6, Caldo BHI con bilis al 40%, Caldo BHI adicionado con 6.5% de NaCl

RECUENTO DE Bacillus cereus

1. Agar Mossel, Agar manitol yema de huevo con polimixina

2. Agar glucosado

3. Medio Voges-proskauer

4. Medio nitratos

RECUENTO DE Staphylocccus  COAGULASA POSITIVO

1. Agar Baird-Parker 

2. Caldo cerebro-corazón

MÉTODO HORIZONTAL PARA LA INVESTIGACIÓN DE Listeria monocytogenes 

1. Caldo Fraser semi (FS)/Caldo Fraser completo (FC)

2. Agar Oxford

3. Agar Palcam

4. Agar triptona de soya-extracto de levadura (TSAYE)

5. Agar sangre de cordero

6. Caldo para la utilización de glúcidos (ramnosa y manitol)

7. Agar movilidad (AM)

PRUEBA DE AUSENCIA/PRESENCIA de Vibrio cholerae

1. TCBS 

2. Agua de peptona alcalina

3. Agar Nutritivo con NaCL al 1% 

4. Agar BHI

5. Caldo de peptona azúcar: glucosa, sacarosa, arabinosa, manosa, manitol e inositol 

6. Caldo L-lisina 1%, L-arginina 1%, L-ornitina 1% 

7. Agar TSI

8. Agar Kliger

9. Caldo Citrato 

PRUEBA DE AUSENCIA/PRESENCIA de Vibrio parahaemolyticus

1. Solución salina al 3%

2. Caldo glucosa- teepol doble fuerza

3. Agua de triptona con 3% de NaCl

4.Caldo lisina (3% NaCl)

5. Caldo VP

6. Caldo nutritivo adicionado de 0, 6, 8 y 10% de NaCl

7. Agar Nutritivo con 3% NaCl

 8. TSI adicionado de NaCl 3%

9. TCBS

PRUEBA DE ENVASES:

1. Agar Rosa de Bengala 

2. Agar Plate Count 

3. Agar chromocult 

3. Caldo caldo letheen 

ESTERILIDAD COMERCIAL: 

1. Caldo BHI, con almidón al 0.1%

2. Cajas de agar BHI

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Caldo Letheen

Medio de subcultivo para la neutralización de compuestos de amonio cuaternario en las pruebas de desinfección y así determinar la actividad antimicrobiana en un envase, en este caso. Usado para determinar el coeficiente de fenol en compuestos catiónicos.  Llamado Letheen por contener lecitina y Tween. 

Compuestos de amonio cuaternario: Moléculas que contienen un átomo de nitrógeno unido a otros cuatro de hidrógeno, se consideran agentes activos catiónicos potentes por su efectividad al eliminar bacterias Gram positivas y Gram negativas. Actúan generalmente como desinfectantes con efectos bactericidas o bacteriostáticos pero también son usados como fungicidas y virucidas. 

El digerido enzimático de tejido animal y el extracto de carne aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano. La lecitina además de ser una fuente nutritiva es capaz de emulsificar neutralizando compuestos de amonio cuaternario y el tween 80, a su vez, neutraliza compuestos como el fenol, la formalina, el hexaclorofeno. La combinación de estos dos últimos compuestos pueden neutralizar el etanol. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y es fuente de electrolitos. 

PH final: 7.0 ± 0.2

Caldo color ámbar claro. 

CONTROL DE CALIDAD

Almacenar a 2-8°C lejos de la luz directa. El producto es ligero y sensible a la temperatura por lo que se debe especialmente proteger de la luz, el calor excesivo, la humedad y la congelación. 

BIBLIOGRAFÍA: 

REMEL. LETHEEN BROTH. Santa Fe Drive, Lenexa, USA. Online: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MBD/Instructions/IFU61268.pdf

Horwitz. (2000). Official Methods of Analysis of AOAC International. Edición 17. Gaithersburg.

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CHROMagar Vibrio

Medio cromógeno usado para el aislamiento y detección de V. parahaemolyticus, V. vulnificus y V. cholerae mediante una coloración diferente de muestras provenientes de alimentos. Se usan por su alta sensibilidad, especificidad y rapidez (resultados en 24 horas). 

En el medio de cultivo la digestión peptídica de tejido animal provee factores de crecimientos necesarios, el cloruro de sodio en alta concentración se debe a la propiedad halófila de la bacterias en estudio y la mezcla cromogénica está protegida actualmente por patente. 

pH: 9.0. Incubación a 37 ° C por 24 horas. 

RESULTADOS ESPERADOS: 

Si se mantiene a una temperatura de almacenamiento adecuada (entre 15 ° C-30 ° C),  tiene una vida útil de 3 años.

BIBLIOGRAFÍA: 

Food&Water Q.C. CHROMagar™ Vibrio. (Última edición 2019). Online: http://www.chromagar.com/food-water-chromagar-vibrio-focus-on-vibrio-species-23.html#.XNXOJ-hKjIU

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Solución salina hipertónica

Solución salina con NaCl al 3%

La solución salina es útil como diluyente para mantener la integridad y viabilidad celular porque carece de propiedades que pueden interferir con las reacciones bioquímicas. La concentración de cloruro de sodio en solución salina al 0,85% (normal) proporciona protección osmótica para las células microbianas.

Sin embargo, Vibrio parahaemolyticus en una bacteria halófila moderada, con un crecimiento óptimo al 3% de NaCl por lo que la solución hipertónica mejoraría su recuperación. La preadaptación con salinidad alta mejora la tolerancia a condiciones de estrés por ácido y aumenta su supervivencia.

La solución salina carece de sustancias nutritivas por lo que no es un caldo de crecimiento microbiano. Sin embargo, puede permitir que su adaptación a las condiciones del medio y permitir su recuperación. 

CONTROL DE CALIDAD:

No debe utilizarse solución salina si hay signos de deterioro (evaporación, decoloración), contaminación o si la fecha de caducidad ha pasado. Proteger del calor excesivo.

BIBLIOGRAFÍA:

Kalburge, Whitaker, Boyd. (2014). High-salt preadaptation of Vibrio parahaemolyticus enhances survival in response to lethal environmental stresses.Department of Biological Sciences, University of Delaware. PubMed. Newark, Delaware, USA.

Anderson, Cumitech. Sistemas de Calidad en el Laboratorio de Microbiología Clínica.  Sociedad Americana de Microbiología. USA

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Caldo glucosa-teepol (doble fuerza)

Usado para el enriquecimiento de Vibrio parahaemolyticus.

El extracto de carne y la triptona proveen aminoácidos, nitrógeno, carbono, vitaminas y demás factores de crecimiento. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, la concentración alta de cloruro de sodio favorece el crecimiento de  Vibrio parahaemolyticus y de igual manera, actúa como inhibidor de microorganismos no halófilos. El teepol inhibe las bacterias Gram positivas al ser un detergente que emulsifica la membrana y el violeta de metilo inhibe actuando sobre la pared. 

La composición del caldo tiene cada componente con el doble de concentración por ende se le llama doble fuerza. Se usa para no dañar la suspensión de NaCl al 3%

incubar a 35 ° C por 18-20 horas

pH 8.4

Al ser el polvo deshidratado muy higroscópico se debe almacenar cerrado herméticamente y a una temperatura entre  10-30°C

BIBLIOGRAFÍA: http://www.liofilchem.net/login/pd/ts/610359_TS.pdf

TECHNICAL SHEET (2017) Glucose Salt Teepol Broth. Italia. Online:

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PRUEBA DE LA CUERDA

Esta prueba se realiza para diferenciar el género Vibrio de otros géneros como Pseudomonas y Aeromonas. La actividad lítica del desoxicolato de sodio  (detergente que emulsifica las grasas) al 0,5% sobre la pared de Vibrio favorece la liberación del ADN de las celulas lisadas que al contacto con el desoxicolato de sodio al 0,5% forma una suspensión adherente o mucoide que al levantar el asa produce hilos o una cuerda. 

Las cepas de V. cholerae son positivas, mientras que por lo general las cepas de Aeromonas son negativas. Otras especies de Vibrio pueden dar una reacción positiva o débil a la prueba de la cuerda

Positivo: Hilo viscoso al levantar el asa

CONTROLES: 

BIBLIOGRAFÍA: 

WHO/CDS/CSR/RMD. (2003) Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Atlanta, Georgia. Online: http://apps.who.int/medicinedocs/documents/s16330s/s16330s.pdf

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AGAR KLIGLER

Prueba bioquímica usada para el reconocimiento y diferenciación de microorganismos en base a la fermentación de la lactosa y la glucosa además de la producción de H2S.

En la composición del agar encontramos que el digerido enzimático de caseína y el digerido enzimático de animal que proveen los factores nutricionales necesarios para el crecimiento. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables y en este caso diferenciales, cuando se usan los productos de la fermentación viran el pH a ácido haciendo que el rojo de fenol, que es el indicador de pH, cambie de color el medio a amarillo. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de H2S que reacciona a su vez con el citrato de amonio férrico, el cual es la fuente de iones férricos. 

Al realizarse la prueba para V. cholerae se suplementa con NaCl al 3%. 

Incubar a  35 ° C por 24-48 horas. Color del medio rojizo. 

SUPLEMENTOS:

En pruebas para Vibrio cholerae se con NaCl al 3% por su carácter halófilo.

RESULTADOS ESPERADOS:

K/K (Pico rojo/fondo rojo): No hay fermentación de azúcares 

A/A (Pico amarillo/fondo amarillo): Hay fermentación de glucosa y lactosa

K/A (Pico rojo/fondo amarillo): Hay fermentación de glucosa 

Ennegrecimiento: Producción de H2S

Burbujas o ruptura del medio: Producción de gas

CONTROL DE CALIDAD: 

Una vez abierto guardar el medio cerrado para evitar la hidratación. Tubos preparados almacenar entre 2-8°C Utilizable hasta la fecha de caducidad.

BIBLIOGRAFÍA: 

REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO S.L. Kligler Iron Agar. Identificación de bacterias Gram negativas. España. Online:http://www.analisisavanzados.com/modules/mod_tecdata/tp/TP00033V.pdf

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CALDO L-LISINA, L-ARGININA, L-ORNITINA

Determina la capacidad de un organismo de producir enzimas que decarboxilen aminoácidos, estas enzimas eliminan una molécula de CO2 de los aminoácidos para formar aminas de reacción alcalina que vira el pH y se produce una coloración violeta. El medio es ácido porque las decarboxilasas no son activas no son activas en un pH alto por lo que también se debe incluir glucosa para producir ácidos mixtos.

Lisina: La enzima lisina decarboxilasa produce cadaverina

Ornitina: Enzima ornitina decarboxilasa produce putrescina

Arginina: Enzima arginina dehidrolasa produce citrulina

La peptona proteosa y el extracto de carne suministran nutrientes necesarios para el crecimiento, el piridoxal es una enzima-cofactor para el aminoácido descarboxilasa. La glucosa es la fuente de carbono que al fermentarse vira el medio a amarillo y estimula la actividad de las enzimas decarboxilasas y dehidrolasas, el púrpura de bromocresol (amarillo a pH: 5.2 y violeta a pH: 6.8) y rojo de cresol (amarillo a pH: 7.2 y rojo a pH: 8.3) son los indicadores de pH y los aminoácidos L-lisina, L-arginina, L-ornitina son lo sustratos para detectar la producción de la enzima apropiada que lo degrada produciendo aminas. Los tubos se cubren con parafina para asegurar anaerobiosis para mantener las aminas más estables.

Incube a 35°C por 18 a 20 horas. 

RESULTADOS ESPERADOS:

Negativo: Color amarillo

Positivo: Color púrpura

CONTROL DE CALIDAD:

Almacenar a 2–12° C, en oscuridad y lejos de la humedad. 

SUPLEMENTOS:

En pruebas para Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus (L-Lisina) suplementar con NaCl al 3% por su carácter halófilo.

BIBLIOGRAFÍA 

Caffer, Terragno, Fraga, Viñas y Pichel (2007). Manual de Procedimientos. Aislamiento, identificación y caracterización de Vibrio cholerae. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas

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CALDOS DE PEPTONA AZÚCAR

Glucosa, sacarosa, arabinosa, manosa, manitol e inositol.

Se usan estos caldos para la diferenciación y reconocimiento de microorganismos en base a su capacidad de fermentación. Para ser incorporados algunos de estos carbohidratos quieren ser degradados en monómeros para su transporte a la célula y ser posteriormente ser metabolizados, se observa por la acidez en el medio de cultivo y formación de gas. La fermentación requiere fosforilación inicial y usa vías de glucólisis. 

En el caldo la proteosa peptona  y el extracto de carne aportan nutrientes, carbono y más factores de crecimiento. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, en el caso de las pruebas para la identificación de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus se aumenta la cantidad a presente para favorecer su crecimiento (NaCl: 3%). El rojo de fenol es el indicador de pH que vira a amarillo (A pH inferiores a 6,8, el cultivo vira a amarillo)  con la acidificación producida por los productos de la fermentación de los carbohidratos.  

Incubar a 35 ° C por 24 horas.

RESULTADOS: 

El metabolismo de la fermentación (fosforilación a nivel del sustrato) produce ácidos  como el ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido málico y esto depende del tipo de carbohidrato que se evalúe en la prueba individual por lo que la enzima encargada del rompimiento de los enlaces de cada carbohidrato también depende del carbohidrato a catabolizar. Los resultados generales son: 

Positivo: Medio amarillo.

Negativo: Medio de color inicial. 

CONTROL DE CALIDAD

Almacenar a menos de  30°C si el medio aún está deshidratado, si ya está preparado almacenar entre 2-8°C. Mantener alejado de la luz y la humedad. 

SUPLEMENTOS:

En pruebas para Vibrio cholerae se suplementa con NaCl al 3% por su carácter halófilo.

BIBLIOGRAFÍA: 

Cavallini, Coronado, Chavarría, Hidalgo. Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. Pag 241

CDC. Identificación de Vibrio cholerae en el laboratorio. Online: https://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Identificaci%C3%B3n-de-Vibrio-cholerae-en-ellaboratorio-cap%C3%ADtulo-6.pdf

Imágenes tomadas de: http://microbitosblog.com/2011/09/27/imagenes-caldo-rojo-de-fenol/

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AGAR/CALDO NUTRITIVO CON NaCl

El agar y el caldo nutritivo se utilizan para el cultivo de una variedad de microorganismos que no tienen una alta exigencia nutricional. Pueden ser usados para la purificación de colonias para posteriormente hacer pruebas confirmatorias. 

La pluripeptona y el extracto de carne proveen nitrógeno, carbono, vitaminas y componentes necesarios para el crecimiento. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. La composición del caldo y del agar es la misma siendo la única diferencia que en el caldo nutritivo no se usa agar como agente solidificante. 

COMPOSICIÓN GENERAL:

 Se suplementa con NaCl par favorecer la recuperación y crecimiento de especies de Vibrio por lo que también actúa como agente inhibidor. 

El caldo nutritivo  puede estar adicionado con 0, 6, 8 y 10% de NaCl para evaluar el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus es diferentes concentraciones de sal. 

pH : 8.5±0.2

Color ámbar. 

Crecimiento de colonias en el medio. 

Crecimiento en Caldo Nutritivo: 

Negativo: No se observa turbidez en el medio 

Positivo: Se observa turbidez en el medio

CONTROL DE CALIDAD 

Almacenar en un lugar oscuro a 2–25 ºC. No congelar ni sobrecalentar y mantener lejos de la humedad. 

BIBLIOGRAFÍA: 

Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana S.A.

HIMEDIA LABS. (2011). High Salt Nutrient Agar M1218. India. Online: http://himedialabs.com/TD/M1218.pdf

Imagenes sacadas de: https://www.slideshare.net/crishilgo/practica-2-exp

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AGAR TCBS (Agar Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa)

El agar TCBS o agar selectivo para Vibrios es un medio altamente selectivo y diferencial para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae y otras especies Vibrio como V. parahaemolyticus y V. vulnificus a partir de muestras provenientes de alimentos. 

En el medio el extracto de levadura, el digerido enzimático de caseína y digerido enzimático de tejido animal aportan nitrógeno, vitaminas y factores necesarios para el crecimiento. El cloruro de sodio además de mantener el balance osmótico actúa como inhibidor de bacterias que no soportan altas concentraciones de sal y estimula el crecimiento de vibrio al estar en una amplia concentración; el citrato de sodio, el colato de sodio y la bilis de buey actúan como agentes selectivos e inhibidores al proporcionar un pH alcalino para inhibir Gram positivos y coliformes, favorecen de igual manera el crecimiento de Vibrio ya que es sensible a pH ácidos. 

El tiosulfato de sodio es la fuente de azufre y reacciona con el citrato férrico para evaluar la producción de H2S. 

La sacarosa es el hidrato de carbono fermentable y ayuda a diferenciar cepas fermentadoras de no fermentadoras por lo que contiene una mayor concentración. El azul de bromotimol (coloración amarilla por debajo de pH: 6,6 y por encima de pH: 7.6 coloración azul) y el azul de timol (coloración amarilla de pH: 2.8 a pH: 8.0 que se vuelve de color azul) son los indicadores de pH que en ambiente alcalino otorgan al medio color verde/azulado y viran a amarillo en ácido por uso de sacarosa. 

pH 8,6 ± 0,2, coloración verde azulada. 

Incubar a 35ºC, durante 18-24 hrs. 

RESULTADOS ESPERADOS:

V. cholerae: Grandes (2-3mm) lisas, amarillas por la fermentación de sacarosa, con el centro opaco por producción de H2S y la periferia traslúcida

V. parahaemolyticus:  Grandes lisas, verdes por la no fermentación de sacarosa, con el centro opaco por producción de H2S y la periferia traslúcida. 

CONTROL DE CALIDAD: 

No requiere esterilización en el autoclave, tiene una vida de almacenamiento relativamente corta una vez preparado (de 3 a 5 días), a menos que las placas se protejan cuidadosamente de la desecación. 

BIBLIOGRAFÍA: 

Rodríguez, E. &Gamboa, M. & Hernández, F. & García, J. (2005). Bacteriología general: Principios y Prácticas de Laboratorio. Costa Rica. Editorial Universidad de Costa Rica. Núm. Pág. 475

CDC.  Aislamiento de Vibrio cholerae a partir de muestras fecales. Online: https://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Aislamiento-de-Vibrio-cholerae-a-partir-de-muestras-fecales_cap%C3%ADtulo-4.pdf

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AGUA DE PEPTONA ALCALINA

Es un medio de enriquecimiento utilizado para la recuperación y enriquecimiento de especies de Vibrio  partir de muestras provenientes de alimentos, antes de su siembra en un medio selectivo para los mismos.   

El agua de peptona alcalina es necesaria para la recuperación selectiva y enriquecimiento de especies de Vibrio debido a que proporciona un medio fuertemente alcalino y con una concentración de sodio elevada; de esta manera favorece y mejora el crecimiento de vibrio al tratarse de un halófilo y tolerante a pH alcalinos. 

pH: 8.4

CONTROL MICROBIOLÓGICO

El polvo deshidratado es de naturaleza higroscópica por lo que se debe cerrar herméticamente. Para su almacenamiento se debe mantener en un lugar seco entre 15°C y 25°C. Proteger de la luz solar directa. El medio ya preparado se puede almacenar hasta máximo un mes. 

BIBLIOGRAFÍA

Oxoid Limited. ALKALINE PEPTONE WATER. UK. Online: http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM1028&c=UK&lang=EN

Ronald M. Atlas (2004). Handbook of Microbiological Media, Third Edition. CRC Press. USA

Imagen tomada de: https://www.fishersci.co.uk/shop/products/alkaline-peptone-water-bottled/10699944

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CAMP  (Factor de monofosfato de adenina cíclica)

Algunas bacterias pueden producir una proteína denominada factor CAMP que presenta un efecto sinérgico con la beta-hemolisina de S.aureus y Rhodococcus equi la cual produce un efecto lítico sobre los eritrocitos de cordero. De esta manera, la actividad hemolítica de la Beta-hemolisina de las cepas de S.aureus y Rhodococcus equi se verá intensificada por la proteína extracelular producida por la cepa en estudio, en nuestro caso L.monocytogenes, que se observa fácilmente como el aumento de dicha hemólisis en el punto de proximidad de la B-hemolisina y el factor CAMP. 

Procedimiento:

Se siembra una línea de referencia de S.aureus en línea recta en una placa agar sangre.

Se siembra una línea recta de referencia de Rhodococcus equi paralela a la de S.aureus al otro extremo de la placa agar sangre.

Se siembra la colonia en estudio en línea perpendicular a la siembra de S. aureus y Rhodococcus equi pero sin tocar las dos lineas anteriores, es decir, en un ángulo recto respecto a la siembra de Rhodococcus equi y S. aureus. 

Incube a 35oC por 24 horas

Resultados esperados: 

Positivo: Formación de una punta de flecha o fósforo de B-hemólisis entre la zona de proximidad entre las dos líneas. (A)

Negativo: Sin formación de punta de flecha o fósforo (B)

BIBLIOGRAFÍA: 

Elmer W. Koneman, Stephen Allen. (2008). Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis: Texto Y Atlas En Color/ Text and Color Atlas. 6ta edición. Ed. Médica Panamericana

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COAGULASA

Comprobar si un microorganismo problema posee la enzima coagulasa.

La prueba de la coagulasa se usa para diferenciar Staphylococcus aureus de los Staphylococcus coagulasa negativos.

Mecanismo de acción de la coagulasa libre:

La procoagulasa (enzima extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma sanguíneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo análogo a la trombina (coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibrinógeno formando un coágulo de fibrina en ausencia de Ca2+.

La coagulasa ligada o factor de agregación actúa directamente sobre el fibrinógeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia de activadores plasmáticos

La prueba se utiliza plasma de conejo que se inocula con una colonia de Staphylococcus aureus. Luego el tubo se incuba a 35ºC con revisión a la ½h, 1h, 4 h, 6h y si es negativo, hasta las 24 horas de incubación, se hace esto para evitar un falso negativo por una reacción retrógrada. Se considera como prueba positiva cuando el coágulo ocupa más de ½ del volumen del ocupado inicialmente por el líquido.  Si es negativo entonces continuamos la incubación por unas 18 horas. 

Resultado positivo: Cualquier grado de coagulación en el plasma de coagulasa.  

Resultado negativo: Sin coagulación en el plasma de coagulasa.

CONTROL DE CALIDAD 

El reactivo contiene material de origen animal y debe manejarse como potencial portador y transmisor de enfermedades, por lo que se deben emplear las normas básicas de bioseguridad para la manipulación y desecho de la prueba.  Conservar a -20°C por hasta 20 días, no descongelar y volver a congelar pues puede perderse la confiabilidad de la prueba.

BIBLIOGRAFÍA: 

Elmer W. Koneman, ‎Stephen Allen. (2008).  Koneman. Diagnostico Microbiologico/ Microbiological diagnosis. 6ta Edición. Editorial Médica Panamericana. Página 616. 

ProLab Diagnostics. RABBIT COAGULASE PLASMA (para uso en Diagnóstico in vitro). 21 Cypress Blvd., Suite 1070, Round Rock, Texas. Online:https://www.pro-lab.com/wp-content/uploads/2017/01/PL850products_Rabbit-Coagulase-Plasma_Spanish.pdf

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AGAR MOVILIDAD

Medio usado para la determinación de movilidad o no de un microorganismo. 

Si el microorganismo es móvil se verá una difusión de la zona de turbidez más allá de la linea de siembre debido al crecimiento. Se da gracias a la consistencia semisolida del medio. 

pH: 7.3 ± 0.2 

Incubar a 25oC durante 48 horas

RESULTADOS ESPERADOS: 

 Neogen Latinoamérica.  Agar para prueba de motilidad. Disponible en: https://foodsafety.neogen.com/sp/motility-test-agar

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Agar sangre de cordero

Agar nutritivo usado para el aislamiento de microorganismos exigentes o no nutricionalmente, se usa para la observación de reacciones hemolíticas.

La peptona y el extracto de levadura aportan las fuentes de nitrógeno, aminoácidos y contenidos nutritivos necesarios. La sangre de cordero es usada para detectar reacciones de hemolísis.

pH 7,3 ± 0,2

Incubar por 24 horas a 35oC

ANÁLISIS DE RESULTADOS: 

Tipos de hemolisis:

Alfa: halos verdosos, oxidación de la hemoglobina de los glóbulos rojos a metahemoglobina en el medio

Beta: halos incoloros, hemolisis total. Resultado esperado Listeria monocytogenes

Gamma: inexistencia de halos, sin hemolisis

CONTROL DE CALIDAD:

El medio preparado debe conservarse en refrigeración, entre 4 y 15 ºC, evitando excesivos choques térmicos y con circulación de aire en la nevera, para evitar hemolizaciones. Evitar de igual manera la cristralización del medio. 

BIBLIOGRAFÍA: 

Agar Sangre.  MDM CIENTÍFICA S.A.S .  O-P.PD-01 Versión 2. Disponible enhttps://mdmcientifica.com/wp-content/uploads/2017/06/Agar-SANGRE-DE-CORDERO-MDM-cient%C3%ADfica-Colombia-O-P.PD-01-INSERTO.pdf

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Caldo Ramnosa y Xilosa

Caldo para determinación de la utilización metabólica de glúcidos. Inocular con asa cada uno de los caldos para evaluar la utilización de carbohidratos según la producción de ácido y el viraje de color del medio a amarillo, en este caso: ramnosa y xilosa.

Se siembra individualmente en tubos con caldo Rojo de fenol-Ramnosa y Rojo de fenol-Xilosa.

Incube a 35 ° C durante 5 días. 

 pH a 7.4

Caldo Ramnosa: Estéril, líquido rojo

Caldo Xilosa: Estéril, líquido rojo

RESULTADOS ESPERADOS: 

Caldo Ramnosa: Listeria monocytogenes: Crece con turbidez y vira a amarillo.

Caldo Xilosa: Listeria monocytogenes: No crece, ni vira el medio. 

Caldos con larga caducidad; 1 año asegurado si se siguen instrucciones de almacenamiento. 

BIBLIOGRAFÍA:

Pascual Anderson, Pascual Anderson.  Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas.Segunda edición. Diaz de Santos. Página 197

CAIJAO. (2006). Listeria monocytogenes DETECCIÓN Y AISLAMIENTO. Laboratorio de Microbiología de Alimentos y Bebidas. INVIMA. Colombia

Imágenes tomadas de: http://www.medioscultivo.com/m-ident-rhamnosa-xylosa-listeria/ y https://issuu.com/jospa7/docs/atlas_2/6