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Biorreactores y la promesa de las células madre para regenerar el corazón.

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Cuando un corazón se daña, por ejemplo, después de un ataque, sus células musculares, llamadas cardiomiocitos, no pueden regenerarse por sí solas. La única solución hasta ahora ha sido el trasplante de corazón, pero la escasez de donantes es un obstáculo enorme.

La ciencia detrás de la solución: Células madre pluripotentes en biorreactores para regenerar el corazón

Biorreactores para regenerar el corazón  - Aquí es donde entra en juego la ciencia de los biorreactores y de las células madre pluripotentes inducidas (conocidas como iPSCs por sus siglas en inglés). Estas células son extraordinarias: tienen una gran capacidad de proliferación y, lo que es aún más importante, pueden transformarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo, incluidos los cardiomiocitos funcionales.

El objetivo es aprovechar estas propiedades para crear un suministro ilimitado de cardiomiocitos sanos que puedan usarse para reparar el tejido cardíaco dañado. Sin embargo, para que esta terapia sea viable a gran escala, necesitamos una forma eficiente y masiva de producir estas células.

El desafío de la producción en masa en biorreactores para regenerar el corazón: Del laboratorio a la terapia

No todas las líneas de células madre se comportan de la misma manera. Algunas tienen un mayor potencial para convertirse en cardiomiocitos que otras, y sus tasas de crecimiento también pueden variar. Por ello, el primer paso en nuestro protocolo es la selección de las mejores líneas celulares.

Una vez identificadas, el siguiente desafío es cómo cultivarlas en grandes cantidades. Aquí es donde los microportadores (microcarriers) juegan un papel clave. Son pequeñas esferas sobre las que las células pueden crecer, permitiendo que se cultiven miles de millones de células en un solo biorreactor. Este sistema, en particular, se utiliza en cultivos en agitadores (spinner culture), lo que permite una producción a una escala mucho mayor que la de las placas de cultivo tradicionales.

Un enfoque integrado para la producción

Nuestro método combina estos dos pasos:

Evaluación inicial: Se evalúa el potencial de diferenciación cardíaca de varias líneas de células madre en un cultivo convencional para seleccionar las más prometedoras.

Producción optimizada: Las líneas seleccionadas se cultivan en grandes cantidades utilizando microportadores en biorreactores, para luego inducir su diferenciación en cardiomiocitos.

Este enfoque integrado nos permite superar el reto de la producción, allanando el camino para que los cardiomiocitos derivados de células madre se conviertan en una fuente terapéutica escalable para tratar enfermedades cardíacas.

Biorreactores y Materiales y equipos clave para el proceso

Para quienes estén interesados en los detalles técnicos, aquí se listan algunos de los equipos y reactivos esenciales para llevar a cabo este protocolo.

Equipamiento mínimo:

Gabinete de bioseguridad: Para un entorno estéril.

Incubadoras de CO2: Para mantener las condiciones ideales de cultivo.

Biorreactores tipo spinner: Vasos de cultivo con agitador magnético para la producción en microportadores.

Microscopio de contraste de fases: Para observar el crecimiento celular.

Citómetro de flujo: Para analizar las características de las células, como su pureza.

Medios y reactivos:

mTeSR™1: Un medio de cultivo específico para mantener la pluripotencia de las células madre.

Medios específicos para diferenciación: Como RPMI-1640 y B27 sin insulina.

Pequeñas moléculas: Como CHIR99021 e IWR1, que se utilizan para guiar la diferenciación de las células madre hacia cardiomiocitos.

Microportadores: Las pequeñas esferas donde las células crecen en grandes cantidades.

Con cada avance en este campo, nos acercamos un poco más a la visión de tener una fuente renovable y segura de células cardíacas, listas para restaurar la función del corazón y salvar vidas.

Artículos relacionados Aquí Biorreactores y la promesa de las células madre para regenerar el corazón.

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Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

Para una mayor inducción de células progenitoras hematopoyéticas, las células se cultivan en medio para células progenitoras hematopoyéticas durante otros 3 a 5 días.

Apague el sistema de control electrónico en los biorreactores y retire con cuidado los frascos T12.5 del rotador de accionamiento biaxial.

Aspire el medio de diferenciación de células progenitoras del endotelio hemogénico y añada unos 30 mL de medio para células progenitoras hematopoyéticas en los frascos T12.5 del grupo RPM.

Coloque los frascos T12.5 en el rotador de accionamiento biaxial y vuélvalos a introducir en la incubadora de CO2 durante 3 días más de cultivo celular.

Cambie el medio con medio fresco para células progenitoras hematopoyéticas de medio volumen cada dos días.

Después de 3 días de cultivo en medio para células progenitoras hematopoyéticas, se forman muchos cúmulos con forma de uva y muchas células redondas flotan en el medio. Las células progenitoras hematopoyéticas diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD34 y CD43.

En el día 2, 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recogen y se preparan para la inmunotinción.

Retire el medio de los frascos y añada PBS a las células para lavarlas 1 o 2 veces.

Aspire el PBS y luego fije con una solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.

Lave las células una vez con PBS y la base de los frascos se divide en pequeños trozos (de 1 cm x 1 cm) con cuchillas afiladas.

Coloque cada pequeño trozo que contenga células en un plato de cultivo celular de 24 pocillos y añada PBS al pocillo.

Permeabilice las células durante 20 minutos con Triton X-100 al 0.2% y suero de burro al 1% a temperatura ambiente (ver Nota 7).

Lave las células dos veces con PBS y añada la solución bloqueante de suero de burro al 5% al pocillo para un bloqueo de 1 hora a 37 °C.

Prepare el anticuerpo primario en suero de burro al 5% en las diluciones recomendadas por el fabricante.

Incube las células en la solución de anticuerpo primario durante toda la noche a 4 °C (o 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes).

Lave las células tres veces con PBS para reducir el fondo fluorescente.

Prepare la solución mezclada que contiene el segundo anticuerpo (diluciones 1:200) y Hoechst 33342 (0.1–1 μg/mL) en PBS con suero de burro al 5%.

Incube las células en la solución mezclada durante 1 hora a temperatura ambiente.

Lave las células dos veces durante 5 minutos en PBS.

Ponga una gota de medio de montaje, añada un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas.

Observe las láminas y adquiera la imagen bajo el microscopio confocal.

Preparación para Inmunotinción (Días 5 y 8)

En el día 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recolectan y se preparan para la inmunotinción.

Disocie las células en células individuales con tripsina al 0.05% y EDTA al 0.1%.

Añada solución inhibidora de tripsina y centrifuge durante 5 minutos a 500 g y 4 °C y deseche el sobrenadante.

Lave las células con tampón de lavado celular (PBS que contiene BSA al 5%).

Cuente las células y resuspéndalas en BSA al 5% en PBS a 1×106 células/mL.

Transfiera 50 μL de suspensión celular a tubos de ensayo.

Añada los anticuerpos primarios purificados y conjugados con fluorescencia diluidos (CD31, CD34 y CD43) a los tubos de ensayo en las diluciones recomendadas por el fabricante. Los controles incluyen: negativo (sin tinción añadida), control de isotipo (con anticuerpo primario no específico etiquetado de manera similar).

Incube en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.

Lave cada muestra tres veces con 2 mL de tampón de lavado celular, centrifugue a 500 g durante 5 minutos a 4 °C.

Añada 500 μL de PBS a cada pellet y resuspenda la muestra celular.

Examine las muestras celulares usando el citómetro de flujo FACS Calibur (BD).

Analice los datos con el software FlowJo, versión 10.0.7.

Notas Adicionales

Si no se va a usar inmediatamente, la placa de cultivo recubierta debe sellarse con parafilm para evitar la evaporación de la solución de Matrigel® y las placas se pueden almacenar a 2–8 °C hasta por 1 semana después del recubrimiento.

Cuando la disociación celular dure aproximadamente 2 minutos en la incubadora, debe verificar el estado de las células para asegurarse de que las colonias estén sueltas y se desprendan del fondo del plato o frasco. No digiera en exceso las células para generar una suspensión de células individuales.

Resuspenda suavemente el pellet celular con una pipeta para evitar generar una suspensión de células individuales. El tamaño de los agregados celulares se puede ajustar alterando el número de veces que la mezcla de agregados celulares se pipetea hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de mantener las células como agregados.

Siembre los agregados celulares a una densidad óptima en el frasco (aproximadamente 100 agregados/cm²). No siembre demasiado denso ni demasiado disperso.

El frasco debe llenarse con un medio de cultivo celular y asegúrese de que la burbuja se extraiga en el grupo RPM.

La alimentación del sistema de control electrónico debe apagarse al preparar el cambio del medio celular.

Este paso se puede omitir cuando se tiñen las células con anticuerpos CD31, CD34 o CD43.

Más información Aquí Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

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Expansión de Células Madre Pluripotentes Humanas sin Células Alimentadoras

En cuanto a las Células Madre Pluripotentes Humanas, antes de la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (CEEh), las CEEh no diferenciadas y dependientes de alimentadoras se cultivan en condiciones libres de alimentadoras y químicamente definidas con el uso del medio TeSR™-E8™ en placas recubiertas con Matrigel Matrix HESC-qualified (Bio-Coat). Podemos omitir este paso si las CEEh se mantienen en medio TeSR™-E8™. Las siguientes instrucciones son las que se utilizan en los experimentos.

Antes de descongelar o pasar las CEEh, recubrir una nueva placa de 6 pocillos con una solución de Matrigel Matrix, y preincubar a temperatura ambiente (25 °C) durante al menos 1 h antes de usar.

Retirar la solución de Matrigel Matrix con una pipeta o por aspiración.

Añadir 2 mL de medio TeSR™-E8™ a la placa de 6 pocillos.

Colocar la mezcla de agregados celulares pequeños (500–1000 agregados/pocillo) en la placa de 6 pocillos que contiene TeSR™-E8™ y observar el estado de los agregados celulares bajo el microscopio para asegurar la densidad celular deseada.

Colocar la placa de 6 pocillos en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Mover la placa con movimientos hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente los pequeños agregados celulares.

Cambiar el medio diariamente con TeSR™-E8™ y monitorear el crecimiento celular a diario hasta el siguiente pasaje o la diferenciación celular.

Antes de la inducción del mesodermo, recubrir cada matraz T12.5 con 1.5 mL de Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix diluido a temperatura ambiente durante 30 min y luego incubar los matraces a 37 °C durante otros 30 min.

En el momento del pasaje celular, digerir las colonias de células  de células madre pluripotentes humanas (CPHh) en pequeños agregados celulares con ReLeSR™ a 37 °C durante unos 3 min.

Detener la digestión con TeSR™-E8™ en el biorreactor, golpear suavemente la placa de cultivo para asegurarse de que los pequeños agregados celulares se desprendan del fondo de la placa.

Recolectar los agregados celulares en un tubo de centrífuga de 15 mL y pipetear la suspensión de agregados celulares suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 3–5 veces para ajustar el tamaño de los agregados a 100–200 células/agregado.

Centrifugar los agregados recolectados a 500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante del tubo de centrífuga de 15 mL y resuspender los pequeños agregados celulares en 2 mL de TeSR™-E8™.

Retirar el líquido de los matraces T12.5 recubiertos con Corning y añadir 2 mL de TeSR™-E8™ al matraz.

Sembrar los agregados celulares en el matraz T12.5 recubierto con Matrigel de Corning a una densidad de aproximadamente 100 agregados/cm2 en TeSR™-E8™.

Colocar los matraces en la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO2​ y 95% de humedad) y agitar los matraces con varios movimientos rápidos de lado a lado y de adelante hacia atrás para distribuir uniformemente los agregados.

Verificar el estado de crecimiento de las colonias celulares al segundo día; si el tamaño de las colonias supera los 300 μm, deberían estar listas para ser cambiadas al medio de diferenciación.

Aspirar el medio del matraz T12.5 y añadir 5 mL de medio de inducción del mesodermo, colocar los matraces en una incubadora para cultivar durante 2 días.

Después de 2 días de cultivo en medio de inducción del mesodermo, hemos observado que casi todas las colonias exhiben una apariencia de colonia suelta y una morfología celular alargada, y dan lugar a células diferenciadas Brachyury.

Después de 2 días de inducción del mesodermo, las células de células madre prrrrrrrrr pluripotentes se cultivan adicionalmente cambiando al medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico. Algunos de los matraces T12.5 con células inducidas a mesodermo se colocan en el rotador de accionamiento biaxial. Los matraces T12.5 y el rotador de accionamiento biaxial se colocan en la incubadora de CO₂ para el cultivo celular.

Aspirar el medio de inducción del mesodermo y añadir 30 mL de medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico a los matraces T12.5 del grupo RPM y añadir 5 mL de medio a los matraces T12.5 del grupo de control (ver Nota 5).

Poner los matraces T12.5 del grupo RPM en el rotador de accionamiento biaxial.

Colocar el rotador de accionamiento biaxial con los matraces T12.5 y los matraces T12.5 del grupo de control en la incubadora de CO₂ a 37 °C con 5% de CO2​ y 95% de humedad para la inoculación y cultivo celular.

Encender el sistema de control electrónico y configurarlo en modelos de velocidad aleatoria (0.1–10 rpm).

Cambiar la mitad del volumen del medio por medio fresco de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico cada dos días.

Después de 3 días de cultivo de células madre pluripotentes en medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico, en el grupo RPM surgieron células con morfología endotelial y estructuras tubulares. Algunas células diferenciadas contenían células redondas con cúmulos "en forma de uva". Las células diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD31 y CD34.

Originalmente publicado Aquí Expansión de Células Madre Pluripotentes Humanas sin Células Alimentadoras

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Expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado

La tecnología de expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado permite la expansión de células de mamífero, lo que puede traducirse en procesos compatibles con las regulaciones de las Buenas Prácticas de Manufactura actuales (cGMP). Las células se introducen en el recipiente del biorreactor, donde los parámetros clave como la temperatura, el pH y los niveles de oxígeno se controlan estrictamente para facilitar el crecimiento a lo largo del tiempo. Aquí, describimos la expansión de células madre pluripotentes humanas basada en microportadores en un biorreactor de tanque agitado de 3 L.

La tecnología de células madr células madre en biorreactores ha avanzado rápidamente desde su desarrollo y continúa revolucionando la medicina personalizada, el desarrollo de fármacos y el modelado de enfermedades. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) pueden diferenciarse, dando lugar a tipos de células clínicamente relevantes como cardiomiocitos y neuronas. Dado que tienen una promesa notable para el desarrollo de terapias curativas, se ha prestado una atención considerable a la expansión a gran escala de estas invaluables células.

La expansión de hPSC requerida para terapias basadas en células utilizando biorreactores aborda las limitaciones clave de los métodos de cultivo 2D convencionales. El cultivo de estas células madre en biorreactores en superficies de vidrio o plástico es un proceso ubicuo en laboratorios académicos e industriales. Sin embargo, la comprensión continua de la biología celular y las mejoras de los métodos respaldan la aplicación de métodos de cultivo 3D. Los métodos de cultivo 3D representan con mayor precisión el microambiente celular que se encuentra in vivo, y las células cultivadas en estos sistemas responden en consecuencia.

Los estudios de desarrollo de fármacos han demostrado diferencias claras en las respuestas de las células cultivadas en 2D frente a 3D, lo que subraya la necesidad de recapitular microambientes celulares complejos para obtener respuestas precisas a los candidatos terapéuticos. Otra limitación crítica de los sistemas de cultivo 2D es la escalabilidad.

Por ejemplo, se requerirán aproximadamente 1×108−1×109 cardiomiocitos derivados de hPSC para reemplazar el considerable número de células perdidas en un infarto de miocardio. Para ello, los biorreactores proporcionan un método robusto, eficiente y escalable para generar un suministro ilimitado de células críticas en muchas indicaciones clínicas.

Aquí, describimos la expansión de hPSC basada en microportadores en un biorreactor de 3 L, lo que resulta en una expansión de alto rendimiento de células madre en biorreactores de alta calidad en 2 semanas de cultivo. El inóculo celular, derivado de células cultivadas en 2D, se introduce en el biorreactor con microportadores de plástico recubiertos de matriz extracelular. En comparación con los cultivos en suspensión que utilizan un método basado en agregados para la expansión, los microportadores proporcionan una gran superficie en la que las células madre en biorreactores se adhieren y crecen.

Se deben realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario. Es necesario limitar la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Se deben almacenar los reactivos según las instrucciones del fabricante.

Descongele una botella de 10 mL de suplemento de medio hPSC L7™ a 37 °C. Agregue todo el contenido a 1 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 1). Invierta la botella dos veces para mezclar y almacene a 4 °C hasta su uso.

Bolsas de 7 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 2).

Solución de pasaje de hPSC L7™ (ver Nota 3).

Solución de pasaje de hPSC F3 (ver Nota 4).

Agua de grado para cultivo celular.

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio (DPBS+/+); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (DPBS-/-); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.

250 μg/mL de matriz hPSC L7™. Agregue 4 mL de agua de grado para cultivo celular a 1 mg de matriz liofilizada (ver Nota 5).

10 mM Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho (ROCK)). Agregue 624,4 μL de DMSO a 2 mg de inhibidor de ROCK. Mezcle con pipeta.

Ensamblar el tubo de inmersión/línea de perfusión, la línea de alimentación de medios y el conjunto de extensión de la línea de recolección.

Autoclavar usando el ciclo seco.

Es iimportante realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario y limite la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Para mantener un ambiente estéril dentro del recipiente del biorreactor y las bolsas de medios de cultivo celular, es necesario desbloquear las tuberías solo cuando introduzca reactivos, medios o inóculo celular o extraiga muestras. Inmediatamente selle la línea y vuelva a bloquear la tubería cuando termine.

Leer más Aquí Expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado

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Expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado

La tecnología de expansión de células madre en biorreactores de tanque agitado permite la expansión de células de mamífero, lo que puede traducirse en procesos compatibles con las regulaciones de las Buenas Prácticas de Manufactura actuales (cGMP). Las células se introducen en el recipiente del biorreactor, donde los parámetros clave como la temperatura, el pH y los niveles de oxígeno se controlan estrictamente para facilitar el crecimiento a lo largo del tiempo. Aquí, describimos la expansión de células madre pluripotentes humanas basada en microportadores en un biorreactor de tanque agitado de 3 L.

La tecnología de células madr células madre en biorreactores ha avanzado rápidamente desde su desarrollo y continúa revolucionando la medicina personalizada, el desarrollo de fármacos y el modelado de enfermedades. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) pueden diferenciarse, dando lugar a tipos de células clínicamente relevantes como cardiomiocitos y neuronas. Dado que tienen una promesa notable para el desarrollo de terapias curativas, se ha prestado una atención considerable a la expansión a gran escala de estas invaluables células.

La expansión de hPSC requerida para terapias basadas en células utilizando biorreactores aborda las limitaciones clave de los métodos de cultivo 2D convencionales. El cultivo de estas células madre en biorreactores en superficies de vidrio o plástico es un proceso ubicuo en laboratorios académicos e industriales. Sin embargo, la comprensión continua de la biología celular y las mejoras de los métodos respaldan la aplicación de métodos de cultivo 3D. Los métodos de cultivo 3D representan con mayor precisión el microambiente celular que se encuentra in vivo, y las células cultivadas en estos sistemas responden en consecuencia.

Los estudios de desarrollo de fármacos han demostrado diferencias claras en las respuestas de las células cultivadas en 2D frente a 3D, lo que subraya la necesidad de recapitular microambientes celulares complejos para obtener respuestas precisas a los candidatos terapéuticos. Otra limitación crítica de los sistemas de cultivo 2D es la escalabilidad.

Por ejemplo, se requerirán aproximadamente 1×108−1×109 cardiomiocitos derivados de hPSC para reemplazar el considerable número de células perdidas en un infarto de miocardio. Para ello, los biorreactores proporcionan un método robusto, eficiente y escalable para generar un suministro ilimitado de células críticas en muchas indicaciones clínicas.

Aquí, describimos la expansión de hPSC basada en microportadores en un biorreactor de 3 L, lo que resulta en una expansión de alto rendimiento de células madre en biorreactores de alta calidad en 2 semanas de cultivo. El inóculo celular, derivado de células cultivadas en 2D, se introduce en el biorreactor con microportadores de plástico recubiertos de matriz extracelular. En comparación con los cultivos en suspensión que utilizan un método basado en agregados para la expansión, los microportadores proporcionan una gran superficie en la que las células madre en biorreactores se adhieren y crecen.

Se deben realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario. Es necesario limitar la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Se deben almacenar los reactivos según las instrucciones del fabricante.

Descongele una botella de 10 mL de suplemento de medio hPSC L7™ a 37 °C. Agregue todo el contenido a 1 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 1). Invierta la botella dos veces para mezclar y almacene a 4 °C hasta su uso.

Bolsas de 7 L de medio basal hPSC L7™ TFO2 (ver Nota 2).

Solución de pasaje de hPSC L7™ (ver Nota 3).

Solución de pasaje de hPSC F3 (ver Nota 4).

Agua de grado para cultivo celular.

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con calcio y magnesio (DPBS+/+); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.

Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (DPBS-/-); pH 7-7,6. Almacenar a 15-30 °C.

250 μg/mL de matriz hPSC L7™. Agregue 4 mL de agua de grado para cultivo celular a 1 mg de matriz liofilizada (ver Nota 5).

10 mM Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de la proteína cinasa asociada a Rho (ROCK)). Agregue 624,4 μL de DMSO a 2 mg de inhibidor de ROCK. Mezcle con pipeta.

Ensamblar el tubo de inmersión/línea de perfusión, la línea de alimentación de medios y el conjunto de extensión de la línea de recolección.

Autoclavar usando el ciclo seco.

Es iimportante realizar los procedimientos utilizando técnica aséptica dentro de una cabina de seguridad biológica a menos que se indique lo contrario y limite la exposición del sistema de cultivo de hPSC L7™ a la luz. Para mantener un ambiente estéril dentro del recipiente del biorreactor y las bolsas de medios de cultivo celular, es necesario desbloquear las tuberías solo cuando introduzca reactivos, medios o inóculo celular o extraiga muestras. Inmediatamente selle la línea y vuelva a bloquear la tubería cuando termine.

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Biorreactores de Volumen de Nanolitros para el Cultivo Celular

Los biorreactores de volumen de nanolíticos para la frabricación de dispositivos microfluídicos consisten en microcanales grabados o estampados en sustratos hechos de polímero, vidrio o silicio. Las intrincadas conexiones de los microcanales a biorreactores con algunas estructuras mecánicas inteligentes como trampas o curvaturas cumplen las funcionalidades deseadas, como la mezcla, la separación, el control del flujo o el establecimiento del entorno para las reacciones bioquímicas. Aquí, describimos los métodos de fabricación de un microbioreactor termoplástico paso a paso. Primero, se realiza la selección del material; luego, se determinan los métodos de producción con el equipo que se puede adquirir fácilmente en un laboratorio. Se eligió COP (polímero de olefina cíclica) por sus características sobresalientes entre muchos polímeros. Se diseñan dos tipos de biorreactores de volumen, con y sin electrodos, utilizando los programas AutoCAD y L-edit. Se emplean la fotolitografía y el grabado electroquímico húmedo para la preparación del molde maestro. Se utiliza un evaporador térmico para la deposición de cromo puro y oro sobre el sustrato de COP, y se usan grabadores para formar los electrodos interdigitados. Una vez producido el molde maestro, se utiliza el termoestampado para obtener la forma diseñada en el COP perforado y planarizado. La cubierta de COP, con o sin electrodos, se une al COP termoestampado mediante termocompresión, y se realiza el dispositivo microfluídico termoplástico. Se conectan tubos al dispositivo y se establece un puente entre el macromundo y el micromundo. Células de levadura o de mamíferos marcadas o etiquetadas con GFP/RFP en productos genéticos específicos se cargan en el dispositivo microfluídico, y se recopilan datos en tiempo real sobre las dimensiones celulares y la intensidad de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertido; finalmente, se utiliza el procesamiento de imágenes para analizar los datos adquiridos.

El éxito sin precedentes de la industria microelectrónica en la integración de dispositivos de biorreactores de volumen de tamaño micro y nano a muy altas densidades utilizando métodos de fabricación como la litografía, la deposición de películas delgadas y el grabado, allanó el camino para el desarrollo de plataformas microfluídicas. La fuerza impulsora de estas tecnologías siempre ha sido miniaturizar los sistemas de análisis bioquímicos de tamaño de escritorio. La principal ventaja de la miniaturización en estos sistemas es la reducción del volumen de la muestra y del reactivo. Los dispositivos microfluídicos también proporcionan una transferencia de calor más rápida, tiempos de proceso más cortos y una mejor automatización. Las aplicaciones biológicas y médicas en el cultivo celular, la detección de fármacos y los sistemas de punto de atención (POC) adoptan la tecnología microfluídica debido a la integración de varios pasos en plataformas únicas automatizadas, lo que las convierte en plataformas potentes para estudios de células individuales. El cultivo, la separación/aislamiento, la detección y el análisis de células individuales se pueden realizar correctamente dentro de los dispositivos microfluídicos a altas tasas de rendimiento, alta reproducibilidad y alta automatización, con un funcionamiento fácil y de bajo costo. Existe una demanda creciente de estas tecnologías microfluídicas en el mercado global. Este mercado se ha segmentado en hospitales y centros de diagnóstico, institutos académicos y de investigación, y compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Los hospitales y centros de diagnóstico son las áreas con la mayor cuota de mercado en este campo. Las tecnologías microfluídicas continúan creciendo y desarrollándose con colaboraciones entre universidades e industrias.

La elección del material para los dispositivos microfluídicos es importante en el estudio de las células. En los últimos años, se han investigado materiales alternativos al vidrio y al silicio entre los materiales elastoméricos y termoplásticos. Los materiales termoplásticos compuestos por moléculas lineales y ramificadas son altamente preferidos debido a su fácil modificación de la superficie y su durabilidad contra los cambios de temperatura y presión en biorreactores de volumen, y tampoco sufren ninguna ruptura estructural. Sin embargo, no es fácil satisfacer los requisitos materiales de las aplicaciones biológicas específicas. Las propiedades ópticas, la termoestabilidad, la estabilidad química y la permeabilidad a los gases son los argumentos clave para la fabricación de dispositivos microfluídicos. Los chips termoplásticos deben ser biocompatibles para que las células sobrevivan y transparentes para poder monitorearlas. Por estas razones, el policarbonato, el polímero de olefina cíclica, el poli(metacrilato de metilo) y el poliestireno destacan en comparación con otros polímeros. Estos polímeros se utilizan comúnmente en la fabricación industrial y poseen excelentes calificaciones ópticas. Permiten la creación rápida de prototipos.

Los métodos de fabricación de los dispositivos termoplásticos son relativamente sencillos en biorreactores de volumen con tanques de acero. Las herramientas de fabricación son de bajo costo y fáciles de usar. El grabado húmedo, el mecanizado convencional, la fotolitografía, el termoestampado, el moldeo por inyección, la ablación con láser y la impresión 3D son algunos ejemplos de métodos de producción. La selección del método de fabricación depende de varios factores, como la disponibilidad de tecnología y equipo, el costo, la velocidad y la capacidad. En este capítulo, se explica la fabricación de dispositivos microfluídicos termoplásticos con y sin electrodos integrados para sistemas simples que no requieren componentes activos como microbombas, microválvulas y sensores. Se utilizan los métodos de fotolitografía, grabado, deposición, termoestampado y unión por termocompresión para la fabricación del dispositivo deseado y cada paso se explica en detalle.

Artículo completo Aquí Biorreactores de Volumen de Nanolitros para el Cultivo Celular

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Métodos de estado estacionario en biorreactores

Los métodos de estado estacionario en biorreactores se basan en una reacción química o bioquímica que ocurre en el líquido, el cual actúa como absorbente de oxígeno. El método de estado estacionario se basa en el flujo de oxígeno y la diferencia entre la concentración de O2 de entrada y la concentración de O2 de salida. Este enfoque permite que el kLa cambie con el tiempo con una reducción en la concentración de oxígeno. En otras palabras, este método utiliza el balance global de oxígeno en la fase gaseosa del reactor. Pueden ocurrir errores notables debido a la pequeña diferencia en la concentración de O2 entre las corrientes de gas de entrada y salida.

El kLa es una medida del uso de oxígeno en sistemas gas-líquido. El valor de kLa es muy importante en la síntesis de productos y biomasa, ya que la obtención metabólica de energía está relacionada con el oxígeno producido por los sistemas de ventilación. Muchas variables son efectivas en el valor de kLa, también conocido como eficiencia de aireación. Estos parámetros son principalmente: turbulencia en el tanque de ventilación, es decir, mezclado, presión del aire, caudal de aire, temperatura, propiedades del fluido (densidad, viscosidad, etc.) y la disponibilidad de inhibidores de espuma.

Para este protocolo de estado estacionario en biorreactores, el tipo de biorreactor elegido es un reactor de tanque agitado con dos deflectores. La capacidad del STR es de 3 L con un volumen de trabajo de 2 L.

Esparcidor: Tipo orificio.

Impulsor: Turbina Rushton de 6 aspas.

Bomba de aire: Usar con tubos de silicona.

Sonda de oxígeno disuelto: Tipo polarográfico.

Detector de temperatura.

Puerto de muestreo.

Unidad de control del biorreactor: Monitorea la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto, la aireación (caudal de gas) y la agitación (velocidad del agitador).

Tanque de nitrógeno: Usar y organizar con regulador de presión.

Obtener el cultivo de reserva de Escherichia coli como organismo modelo para la producción aeróbica en biorreactor.

Preparar el medio de crecimiento Luria-Bertani (LB) en forma de caldo y agar para E. coli con los siguientes componentes para 1 L: 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura y agua destilada. Añadir agar-agar (2%) con estos componentes para el medio de agar.

Utilizar la concentración celular de E. coli a una longitud de onda de 600 nm.

Medir el tiempo y también obtener los valores de concentración de OD correspondientes a esos tiempos.

Instalación del Biorreactor

Usar la forma de orificio del esparcidor de estado estacionario en biorreactores que es responsable de la entrada de burbujas de aire al biorreactor a través de la bomba de aire.

Localizar el puerto de la turbina Rushton en el STR (ver Nota 5).

Instalar el puerto de muestreo, el detector de temperatura y la sonda de OD de tipo polarográfico dentro del biorreactor.

Esterilizar en autoclave el biorreactor con todas sus piezas colocadas dentro durante 20 min a 121 °C.

Preparación del Medio de Crecimiento

Preparar medio de agar para mantener el cultivo de reserva en placas Petri o tubos inclinados. Pesar los componentes de triptona, NaCl y extracto de levadura más agar-agar según los volúmenes requeridos y mezclarlos en el agua destilada. Hervir la solución para homogeneización.

Preparar los componentes del medio de caldo para la ampliación desde las placas Petri de agar hasta el volumen final de inoculación del biorreactor. Comenzar con volúmenes de 5 mL en tubos y continuar con volúmenes de 10, 20 y 40 mL, respectivamente. Pesar todos los componentes excepto el agar-agar y mezclarlos en el agua destilada en las cantidades requeridas.

Preparar por separado el medio de crecimiento para el biorreactor en un volumen de 2 L.

Medir los valores de pH de los medios de crecimiento y ajustar el pH a un rango entre 7.5 y 8.

Esterilizar en autoclave todos los medios de crecimiento y equipos durante 20 min a 121 °C.

Para el medio de agar: Poco después de la esterilización, verter el medio de caldo en condiciones asépticas en placas Petri/tubos estériles mientras la temperatura media es de aproximadamente 60 °C y dejar solidificar por enfriamiento.

Preparación del Microorganismo

Inocular las células de E. coli en medio de agar con asa de inoculación en condiciones asépticas, primero. Cultivar las células a 37 °C.

Después de que las colonias crezcan en la placa Petri, tomar una sola colonia de la placa y transferir a 5 mL de medio de caldo. Escalar hasta 40 mL de medio de caldo en un Erlenmeyer de 250 mL siguiendo el crecimiento del cultivo.

Usar los 40 mL de cultivo para inocular el biorreactor.

Operación del STR

Después del proceso de esterilización de estado estacionario en biorreactores, transferir el medio de crecimiento estéril al biorreactor en condiciones asépticas.

Inocular el 2% (v/v) de las células correspondientes a 40 mL en el biorreactor en condiciones asépticas.

Conectar la bomba de aire al cabezal del puerto del esparcidor con tubo de silicona.

Operar el STR bajo condiciones adecuadas a 150 rpm y 1 vvm (37 °C) siguiendo las indicaciones de la unidad de control del biorreactor.

Medición del Coeficiente de Transferencia de Oxígeno: kLa

Verificar continuamente la densidad óptica de las células para seguir el crecimiento.

Después de que las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico, estar listo para la determinación de kLa mediante el método dinámico en el biorreactor.

Para la desoxigenación del caldo en ese momento, conectar el  tanque de acero  de nitrógeno.

Inyectar gas nitrógeno en el biorreactor para desplazar el oxígeno.

Usar la sonda de OD y monitorear los cambios en la concentración de OD.

En este período, C disminuye.

Después de observar el valor de OD como 0% de saturación (o cerca del 0%), cortar el suministro de nitrógeno.

Después de que C disminuya, airear el caldo de fermentación mediante bombeo en condiciones de operación específicas, como un flujo de aire constante conocido.

En función del tiempo, C aumenta. Monitorear este cambio en la concentración de OD siguiendo el inicio del flujo de aire (Fig. 1).

Medir los valores de C en diferentes momentos en el biorreactor y registrar estos varios valores con respecto al tiempo usando un cronómetro para la gráfica.

Asumir que la reoxigenación del caldo de fermentación es rápida en comparación con el crecimiento celular, de modo que el nivel de OD alcanzará un valor de estado estacionario en poco tiempo. C*, que es el valor de estado estacionario, muestra un equilibrio entre el suministro y el consumo de oxígeno.

Publicado en Aquí Métodos de estado estacionario en biorreactores

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Medición del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Masa en un Biorreactor de Tanque Agitado

Un biorreactor de tanque agitado es un recipiente controlado que permite conversiones biológicas en componentes bioactivos utilizando células o enzimas. En los procesos aeróbicos, es importante conocer los requerimientos de oxígeno de las células, que pueden variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana, el envejecimiento, el agotamiento del sustrato y la formación de productos, etc. Aquí describimos la medición del coeficiente volumétrico de transferencia de masa (kLa) en un biorreactor de tanque agitado utilizando el método dinámico basado en estado no estacionario, que también es un parámetro significativo, especialmente en la ampliación de escala. El equipo para la medición según el método dinámico tiene un bajo costo en comparación con la metodología de estado estacionario. Este método es confiable en la determinación de kLa cuando el tiempo de residencia del gas y la sonda que mide la concentración de oxígeno del tiempo de respuesta cumplen con requisitos específicos.

La transferencia de gas se define como el proceso en el que el gas se mueve de una fase a otra. Este fenómeno se utiliza en la transferencia de masa y la transferencia de oxígeno para la continuidad de los procesos biológicos durante la bioproducción en un biorreactor de tanque agitado. La transición de oxígeno de la fase gaseosa a la fase líquida es crucial para el proceso aeróbico, especialmente para: la producción de enzimas, la formación de productos relacionados con la biomasa, el tratamiento de aguas residuales y los cultivos de células animales.

Los microorganismos aeróbicos en el caldo de fermentación producen la energía necesaria para su supervivencia y crecimiento utilizando moléculas de oxígeno disuelto. El oxígeno, como todos los gases en la atmósfera, se disuelve en el agua hasta cierto grado. La concentración de oxígeno disuelto (OD) depende en gran medida de la temperatura, la presión y el nivel de salinidad del agua. La concentración máxima de OD a 1 atm y temperatura ambiente es de 8.26 mg/L para agua pura.

En los bioprocesos donde intervienen microorganismos aeróbicos, es muy importante mantener el nivel deseado de concentración de OD en el caldo de fermentación. Varios organismos necesitan niveles muy altos de oxígeno para la formación de productos relacionados con la biomasa. Esto requiere una medición continua de la concentración de OD en el biorreactor de tanque agitado y un sistema de control que reaccione rápidamente cuando haya una desviación de los valores diseñados según las necesidades de los microorganismos. Debido a que el número de microorganismos en el fermentador y su tasa metabólica cambian con el tiempo, el requerimiento de oxígeno del sistema tampoco permanece constante durante la fermentación.

La concentración de OD puede variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana. Se han propuesto métodos físicos y químicos para la medición del kLa en bioreactores tanque agitados (STR). En los bioprocesos, los métodos de estado estacionario y no estacionario son los más preferidos. Estos métodos tienen ventajas superiores para varios casos según su aplicación.

La técnica de estado no estacionario (también conocida como dinámica) es el método más utilizado para medir la concentración de OD. Se basa en el monitoreo de la disminución de la concentración de OD con un electrodo de oxígeno al cortar el aire (oxígeno) que alimenta el biorreactor, y el aumento de la concentración de oxígeno al realimentar el aire (oxígeno). Básicamente, el nivel de OD se espumosa con nitrógeno o se reduce a cero añadiendo sulfuro de sodio. Luego, se sigue el aumento de la concentración de OD en función del tiempo.

El método de estado no estacionario consta de dos etapas: consumo y absorción. La aireación se detiene y el OD disminuye debido a la respiración celular durante la etapa de consumo. En la etapa de absorción, se reanuda la aireación y el OD aumenta hasta alcanzar un estado estacionario. A menudo es difícil obtener un kLa preciso utilizando el método de estado no estacionario. Porque, en primer lugar, las suposiciones sobre el grado de mezcla de la fase gaseosa deben elegirse correctamente. En segundo lugar, el tiempo de respuesta del electrodo debe ser rápido. Sin embargo, es comúnmente utilizado porque da un resultado más preciso.

Durante la transferencia de oxígeno del aire al agua, la resistencia real ocurre en la capa de la película líquida en la interfaz. Dentro del biorreactor donde no se consume oxígeno, cuando se desprecia la resistencia en la fase gaseosa, el cambio dependiente del tiempo de la concentración de OD viene dado por:

qOx​=kLa​(C∗−CL​)=OTR

donde:

kL​ es el coeficiente de transferencia de oxígeno (cm/h)

a es el área interfacial gas-líquido (cm²/cm³)

kLa​ es el coeficiente volumétrico de transferencia de masa (h⁻¹)

C∗ es la concentración de oxígeno disuelto saturado (mg/L)

CL​ es la concentración real de oxígeno disuelto en el caldo (mg/L)

qOx​ es la velocidad de transferencia de oxígeno (mg O₂ L⁻¹ h⁻¹)

El sistema en el STR no está en estado estacionario durante la reoxigenación. En este paso, la velocidad de cambio de la concentración de OD es igual a la velocidad de transferencia de oxígeno del gas al líquido. Si la velocidad de cambio de la concentración de OD con el tiempo es igual a cero y la concentración final de OD como valor estacionario es igual a CL​ (C∗=CL​), se podría obtener una expresión.

Artículos relacionados Aquí Medición del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Masa en un Biorreactor de Tanque Agitado

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¿Qué son los Biorreactores?

Los biorreactores de tanque agitado son aparatos manufacturados que permiten la generación de un ambiente específico para el cultivo altamente controlado de células vivas.

Originalmente utilizados para sistemas de producción microbiana, han encontrado amplias aplicaciones en campos tan diversos como la producción de vacunas, el cultivo de células vegetales y el crecimiento de organoides cerebrales humanos, y existen en diseños igualmente diversos.

La fabricación de productos biológicos se realiza actualmente en su mayoría utilizando un biorreactor de tanque agitado y células huésped CHO, y representa el proceso de producción en biorreactor más "clásico".

La preparación y operación de un biorreactor (también conocido como proceso upstream en un entorno biotecnológico/industrial) se compone de tres pasos principales: expansión (generación de biomasa), producción (proceso por lotes, por lotes alimentados o continuo) y cosecha.

Expansión de las células en biorrectores

La expansión de las células puede durar desde unos pocos días hasta semanas, dependiendo del número de células al inicio, el tiempo de duplicación celular y la biomasa requerida para inocular el biorreactor de producción.

La fase de producción en biorreactores de tanque agitado dura unas pocas semanas y es una fase altamente sensible, ya que la concentración de diferentes químicos y los parámetros físicos deben ser estrictamente controlados.

Finalmente, la cosecha permitirá la separación del producto de interés de las partículas grandes y luego el material deseado (sobrenadante del cultivo celular o células) se transferirá al proceso downstream.

Las materias primas utilizadas durante la fase upstream (los tres pasos) deben estar alineadas con el propósito final del producto manufacturado, ya que la presencia de impurezas residuales puede tener un impacto en la idoneidad del producto final para el propósito deseado.

Para la producción de proteínas terapéuticas complejas como los anticuerpos recombinantes en biorreactores de tanque agitado, las líneas celulares de mamíferos han sido el caballo de batalla de la industria durante las últimas tres décadas.

Células de ovario de hámsper chino

Las células de ovario de hámster chino (CHO), en particular, han encontrado una amplia aplicación, ya que tienen un historial de uso seguro, exhiben una capacidad de crecimiento robusta con tiempos de duplicación razonables, pueden modificarse fácilmente para expresar transgenes de interés y sus productos muestran modificaciones post-traduccionales compatibles con el uso en humanos.

Actualmente se emplean diferentes modos de operación, desde sistemas de microportadores hasta diferentes variantes de procesos de perfusión.

Sin embargo, a pesar de un creciente interés en las tecnologías de perfusión en el cultivo de células de mamíferos, el cultivo clásico por lotes alimentados de líneas celulares en suspensión en biorreactores de tanque agitado es actualmente la técnica más utilizada, especialmente a mayor escala.

Como resultado, se han desarrollado una serie de soluciones "listas para usar" que van desde medios de cultivo celular optimizados hasta plataformas de expresión completas que proporcionan las células huésped, los consumibles necesarios y las recetas para el cultivo en biorreactores.

Utilizando estas tecnologías, las proteínas recombinantes secretadas pueden producirse con relativa facilidad en concentraciones volumétricas que oscilan desde cientos de miligramos por litro para proteínas difíciles de expresar hasta varios gramos por litro de medio de cultivo para proteínas fáciles de expresar, lo que hace que el enfoque sea atractivo tanto para la investigación pura como para el uso biotecnológico.

El flujo de trabajo para el cultivo celular en biorreactores generalmente comienza con la descongelación de las células que expresan una proteína recombinante de interés. La generación de tales poblaciones celulares se describe en otro lugar.

Los crioviales de las poblaciones celulares se congelan y se denominan banco celular.

Después de la descongelación del banco celular, las células se cultivan en recipientes de tamaño creciente, típicamente comenzando con pequeños matraces de agitación, con el objetivo de mantener las células en crecimiento logarítmico (el tren de siembra) hasta que estén disponibles en cantidades suficientes para inocular el/los biorreactor/es de producción.

Para reducir la heterogeneidad en la población celular, las células utilizadas para la fabricación de productos biológicos suelen ser de derivación clonal, lo que significa que una población celular se inició a partir de una sola célula.

Dicha población celular a menudo se denomina "clon", aunque existe una heterogeneidad significativa incluso en una población así.

Luego, las células se cultivan bajo condiciones estrictamente controladas durante 1 a 3 semanas con nutrientes añadidos en forma de alimentaciones, ya sea a intervalos predefinidos o basados en el consumo por parte de las células.

Los medios y alimentaciones libres de componentes de origen animal (generalmente abreviados ADCF o ADF) y químicamente definidos (generalmente abreviados CD) han reemplazado en gran medida a los medios anteriores que incluían suero bovino o de ternera o hidrolizados, ya que reducen el riesgo de introducción de patógenos, muestran una menor variabilidad entre lotes y simplifican la purificación y las pruebas posteriores.

En los últimos años, las tecnologías de un solo uso han encontrado una amplia aplicación tanto en la producción como en la investigación, ya que permiten omitir los pasos de limpieza y esterilización que requieren mucho tiempo y mano de obra, reducen el tiempo de respuesta del equipo y tienen como objetivo mejorar la reproducibilidad.

Es importante destacar que el riesgo de contaminación cruzada con material de un lote anterior se elimina por completo.

La operación general y el equipo requerido solo difieren en detalles menores entre los enfoques de un solo uso y los de múltiples usos.

Artículo completo Aquí ¿Qué son los Biorreactores?

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Procesos en biorreactores

Usualmente, los biorreactores están integrados en plantas complejas, donde se utilizan tanto procesos upstream como downstream. Estos procesos en biorreactores muestran interacciones complejas y dinámicas entre las unidades de proceso.

Estas complejas dinámicas de proceso pueden tener una influencia significativa en la eficiencia de recursos y energía de una planta de producción biotecnológica completa.

El simulador de entrenamiento de una planta de bioetanol ha sido desarrollado para investigar la influencia de las estrategias de control de procesos y automatización en la eficiencia de recursos y energía de una planta de bioetanol.

El simulador consta de dos biorreactores: una unidad de filtración de flujo cruzado y una columna de destilación. Se utiliza S. cerevisiae como organismo productor de etanol. En el biorreactor 1 (B-8) se produce aeróbicamente el cultivo iniciador y luego se transfiere a un biorreactor 2 (B-17) operado anaeróbicamente para la producción de etanol.

Ambos biorreactores tienen un volumen de trabajo máximo de 15 l. La suspensión de etanol-levadura-agua se alimenta a una unidad de filtración de flujo cruzado (F-1), que se utiliza para reciclar la biomasa al biorreactor operado anaeróbicamente. La solución filtrada de etanol-agua se alimenta a una unidad de destilación a presión normal (C-1).

De esta unidad se obtienen dos corrientes. La corriente superior contiene principalmente etanol y la corriente inferior contiene principalmente agua más sustratos residuales y subproductos con baja presión de vapor. El simulador de planta de bioetanol puede operarse en modo discontinuo (batch), semicontinuo (fed-batch) y continuo.

Todos los modelos de procesos en biorreactores para los simuladores de las unidades de operación individuales han sido validados sobre la base de datos experimentales.

Como el simulador debería utilizarse para investigar el impacto de las estrategias de control de procesos en la eficiencia de recursos de la planta de bioetanol, el simulador tenía que ser capaz de describir el comportamiento dinámico de la planta completa, incluyendo la cinética de (bio)reacción, la cinética de transferencia de calor y masa, la dinámica de los procesos en biorreactores, la unidad de filtración de flujo cruzado o la columna de rectificación, así como el comportamiento dinámico de las válvulas, bombas, compresores, intercambiadores de calor, dispositivos de medición y otros elementos de la planta.

Además, se requería un modelo del sistema de automatización completo del proceso, que se realizó en dos niveles. Primero, los lazos de control PID requeridos se implementaron de manera similar a la planta real.

Segundo, la secuencia operativa para la operación de la planta se modeló utilizando GRAFCET (Graphe Fonctionnel de Commande Etapes/Transitions, IEC 60848, IEC 1131-3), que es un SFC y puede utilizarse para describir gráficamente cualquier secuencia operativa para un proceso.

El simulador de procesos en biorreactores de planta de bioetanol brevemente descrito se aplicó para realizar estudios sobre el impacto de diferentes estrategias operativas en la eficiencia de recursos de la planta. Se utilizaron planes GRAFCET con diferentes conjuntos de valores de parámetros para realizar diferentes procedimientos operativos.

Como resultado, los autores concluyen que las estrategias y condiciones operativas para el proceso global pueden llevar a una variación de las demandas de energía para la producción de etanol del 48%.

Este ejemplo ilustra la importancia de una capacitación bien realizada de los operadores de planta, ya que sus decisiones con respecto a los procedimientos operativos pueden tener un impacto importante en los rendimientos del producto, así como en la operación eficiente en recursos y energía de plantas biotecnológicas y biorreactores complejos.

Los procesos industriales con biorreactores exhiben un comportamiento dinámico complejo. Esto genera altas demandas en las habilidades operativas de los operadores de planta. También en la investigación, los experimentos de cultivo en biorreactores a escala piloto son de creciente complejidad dinámica, lo que requiere muy buenas habilidades operativas del personal de investigación y los estudiantes.

La alta interdependencia de subprocesos biológicos, químicos, físicos y técnicos complejos dificulta la educación y capacitación de operadores y técnicos, así como de estudiantes de ingeniería bioquímica, para la operación y el análisis de procesos en biorreactores eficientes de los bioprocesos.

embargo, varios estudios demuestran que los simuladores de entrenamiento ofrecen una herramienta interesante para mejorar eficazmente las habilidades operativas de operadores de planta, técnicos, ingenieros y estudiantes de ingeniería y tecnología bioquímica, lo que a su vez puede conducir a una reducción significativa de los costos de producción.

Además, los simuladores de entrenamiento pueden utilizarse como sistemas de prueba de control digital y apoyar el desarrollo de sistemas de control, así como el desarrollo de nuevas estrategias de operación automatizada y control avanzado.

A pesar de su complejidad, el modelado exitoso de bioprocesos ha sido demostrado por científicos durante muchos años y los modelos ahora forman una base de conocimiento muy poderosa para estos procesos.

Las potentes computadoras personales, las herramientas de simulación y las estrategias de modelado en combinación con una gestión de proyectos eficiente hacen posible utilizar estos modelos como base para los simuladores de entrenamiento.

Sin embargo, dado que el modelado es un factor de costo importante en el desarrollo de simuladores de entrenamiento, se recomienda crear bibliotecas de modelos y facilitar el uso múltiple de modelos de procesos matemáticos.

Fuente original Aquí Procesos en biorreactores

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Biorreactores de digestión anaeróbica

Los biorreactores de digestión anaeróbica suelen ser bastante grandes con volúmenes de hasta 20000 m³. A diferencia de otros bioprocesos, en la digestión anaeróbica, una población de diferentes organismos necesita interactuar para hidrolizar los sustratos básicamente indefinidos y formar biogás, una mezcla de gases que contiene principalmente metano y dióxido de carbono.

En el reactor tienen lugar complejos procesos biológicos, químicos y físicos que están influenciados por estrategias de control de procesos adecuadas. Un desafío para el desarrollo de simuladores de entrenamiento es la combinación de los procesos biológicos, que son bastante lentos, con los procesos técnicos, que son rápidos.

El simulador de entrenamiento de biogás es un buen ejemplo de simulador de entrenamiento multipropósito. Se desarrolló como un probador de sistemas de control digital (DCS-tester) para apoyar la construcción y prueba de lazos de control y un sistema de control de procesos para una planta de biogás de laboratorio.

Los biorreactores de digestión anaeróbica se utilizaron para desarrollar nuevas estrategias de control e investigar la interdependencia de los efectos biológicos/fisicoquímicos con los efectos técnicos dentro de un proyecto de investigación.

A partir de esta especificación, se dedujeron las exigencias para el modelo matemático del proceso. El modelo tenía que ser capaz de simular procesos de digestión anaeróbica de diversos sustratos en modo discontinuo (batch), semicontinuo (fed batch) y continuo con una precisión adecuada, manteniendo el balance de masa.

Las variables de estado modeladas debían incluir las concentraciones de metano y dióxido de carbono, la tasa de producción de biogás, el pH, la temperatura en el reactor/medio y la presión en el espacio de cabeza del reactor. Además de los procesos biológicos en biorreactores de digestión anaeróbica, bioquímicos y fisicoquímicos relevantes, se tuvo que modelar la dinámica de los sensores y actuadores para permitir el desarrollo del controlador.

Como el proceso de biogás es muy lento, se tuvo que implementar un modo de simulación acelerado 200 veces. El cálculo del modelo tenía que ser posible en sistemas PC convencionales, manteniendo la estabilidad numérica y una alta velocidad de cálculo.

Además, este simulador de entrenamiento se basa en cuatro submodelos interactivos que describen los subsistemas biológico, fisicoquímico, del reactor y de la planta del proceso global. Los biorreactores de digestión anaeróbica se adaptaron para simular un reactor de laboratorio de 10 litros que procesaba tres sustratos bien definidos diferentes, así como mezclas variables de estos compuestos.

Los submodelos biológico y fisicoquímico se implementaron en el lenguaje de programación FORTRAN; los submodelos del reactor y de la planta se implementaron directamente en un programa industrial de control de procesos y simulación. Los submodelos combinados se conectaron a varios lazos de control, automatizaciones, sistemas de adquisición de datos e interfaces gráficas de usuario.

El submodelo biológico se basa en un modelo descrito por Bernard et al. y se adaptó para procesar mezclas complejas de sustratos de carbohidratos, proteínas y lípidos, que son degradados por bacterias acidogénicas para producir ácidos grasos volátiles (AGV) y generar subproductos como dióxido de carbono y nueva biomasa. Los AGV son posteriormente degradados por bacterias metanogénicas para formar metano (CH4), dióxido de carbono (CO2) y nueva biomasa.

Se utilizaron cinéticas de tipo Monod para modelar las tasas de captación de sustrato en función de las concentraciones de sustrato o intermediarios. Además, se implementaron funciones que describen la inhibición del proceso biológico debido a temperaturas, pH y concentración de AGV subóptimos.

El submodelo fisicoquímico describe el pH en el medio de reacción, el fraccionamiento del carbono inorgánico total (CIT) en bicarbonato (HCO3−), ácido carbónico (CO32−) y dióxido de carbono (CO2), las presiones parciales de dióxido de carbono y metano en la fase líquida y los flujos de masa de estos gases hacia el espacio de cabeza del reactor. El pH está influenciado por algunos de los componentes iniciales del sustrato (es decir, proteínas), los AGV y los flujos de ácido y álcali de entrada para permitir el control del pH.

El modelo ideal de reactor de tanque agitado básicamente comprende un sistema de 13 ecuaciones diferenciales no lineales que modelan las concentraciones de biomasa, sustrato y producto dentro del caldo de cultivo. Su estructura es similar a la del simulador de entrenamiento de biorreactores.

El submodelo de la planta comprende todos los componentes de la planta. El modelo de la planta se puede adaptar para simular diferentes configuraciones de planta. Los agregados modelados incluyen válvulas, bombas, tanques, conductos y sensores. La dinámica de los actuadores e instrumentos se modeló con precisión para permitir el diseño de lazos de control y automatizaciones. Se añadió ruido de medición a las variables de estado calculadas.

El simulador de entrenamiento se aplicó para el desarrollo y prueba de controladores básicos y funciones del sistema de control, el desarrollo de nuevos esquemas de control de lógica difusa para reactores de biogás, la investigación de la influencia de los aspectos técnicos en las señales de medición utilizadas para el análisis y control de procesos y, finalmente, para la formación y educación universitaria.

Se informó que los lazos de control importantes, por ejemplo, para nivel, temperatura y pH, pudieron diseñarse y probarse adecuadamente con el simulador y luego se aplicaron en una planta de laboratorio real. Además, se desarrolló con éxito una estrategia compleja de alimentación de sustrato con el simulador, evitando los efectos inhibidores, típicos de los procesos de biogás.

La simulación acelerada, en biorreactores de digestión anaeróbica, 200 veces demostró ser muy útil no solo en la formación y educación de los estudiantes, sino también para el desarrollo de un controlador de lógica difusa, ya que la parametrización del controlador requirió un número bastante elevado de experimentos de simulación.

Un beneficio adicional del simulador surgió del análisis de la dinámica de las mediciones del proceso con respecto a las influencias biológicas y técnicas. Este análisis ilustró la sensibilidad de la precisión y la dinámica de las mediciones de los gases de escape a las tasas de flujo de gas y los efectos de dilución, y por lo tanto contribuyó a mejorar la configuración de la planta piloto.

Más información Aquí Biorreactores de digestión anaeróbica

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El primer Simulador de Entrenamiento en Biorreactores

El primer simulador de entrenamiento en biorreactores fue publicado por primera vez por Hass, utilizando como ejemplos el cultivo de levadura de panadero y la fermentación etanólica. Este simulador fue luego desarrollado aún más por Gerlach y otros para describir la producción de proteínas recombinantes con *E. coli*. Una derivación del simulador fue desarrollada por Hass y Pörtner y fue incluida en un libro de texto dirigido a ingenieros en bioprocesos y biotecnólogos.

Los grupos objetivo para el simulador de entrenamiento en biorreactores son técnicos e ingenieros, así como estudiantes de biotecnología, ingeniería bioquímica y campos relacionados. Los objetivos del entrenamiento con este simulador son apoyar la enseñanza de los fundamentos de la ingeniería bioquímica y, principalmente, proporcionar capacitación industrial y académica para la operación de entrenamiento en biorreactores de tanque de acero agitado mediante sistemas modernos de control de procesos; también busca ofrecer formación para la realización de experimentos reales de cultivo y la planificación de estrategias operativas para biorreactores. El simulador de entrenamiento fue diseñado para capacitar en el arranque de biorreactores, así como en las operaciones por lotes, alimentación continua y funcionamiento continuo. Finalmente, puede ser utilizado en la capacitación de ajuste de controladores para los lazos de control de biorreactores.

La levadura *S. cerevisiae* presenta características metabólicas que son particularmente adecuadas para demostrar la interdependencia entre el metabolismo microbiano, las estrategias operativas del entrenamiento en biorreactores y el rendimiento general del proceso. El proceso de cultivo es relevante a nivel industrial y también puede llevarse a cabo en laboratorios universitarios y prácticas. La levadura obtiene su energía para crecer metabolizando glucosa tanto en condiciones aeróbicas (respiración) como anaeróbicas (fermentación).

Durante la fermentación anaeróbica, *S. cerevisiae* produce dióxido de carbono y etanol como productos de la glucólisis. Bajo condiciones aeróbicas, el etanol puede utilizarse como sustrato si no hay glucosa disponible (crecimiento diauxico). De particular interés para la operación y control del proceso está el efecto Crabtree. *S. cerevisiae* produce etanol incluso bajo condiciones aeróbicas si hay más glucosa disponible de la que puede metabolizarse a través de la cadena respiratoria. Además, el producto etanol muestra efectos inhibitorios.

A partir de las propiedades biológicas del organismo, pueden deducirse estrategias operativas. Para maximizar el rendimiento de biomasa a partir del sustrato de carbono y producir una concentración máxima de biomasa, debe aplicarse una estrategia de alimentación por lotes continuos o semicontinuos (fed-batch), manteniendo la concentración de glucosa baja. Al mismo tiempo, la estrategia de burbujeo y agitación debe asegurar niveles suficientes de oxígeno en el caldo de cultivo; el pH y la temperatura deben ajustarse y controlarse en condiciones óptimas para el crecimiento. La dinámica general del proceso requiere controladores bien ajustados en una amplia gama de condiciones operativas.

Cepas genéticamente modificadas de *E. coli* se utilizan para producir proteínas recombinantes, como la proteína verde fluorescente (GFP). Gerlach y otros extendieron el simulador de entrenamiento en biorreactores con un modelo para la producción de GFP utilizando *E. coli*. La producción de GFP se induce mediante la adición de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a concentraciones específicas de biomasa. Durante el cultivo aeróbico, *E. coli* produce varios ácidos orgánicos, que pueden mostrar efectos inhibitorios sobre el crecimiento a ciertas concentraciones elevadas.

Este proceso también es relevante a nivel industrial y puede realizarse en laboratorios universitarios. Aquí, pueden investigarse estrategias de alimentación e inducción con respecto al rendimiento de GFP, y entrenarse el monitoreo y control de un proceso bastante complejo utilizando datos en línea y fuera de línea.

Ambos organismos se cultivan en un biorreactor de tanque de acero agitado de 20 L (acero inoxidable). El reactor está equipado con tanques de alimentación, ácido, base, antiespumante y producto, así como con las bombas correspondientes. El suministro de oxígeno se realiza a través de una estación de mezcla de gases (aire, oxígeno, nitrógeno), donde se pueden ajustar las tasas de gaseificación. El control de temperatura se logra mediante una camisa de calentamiento. El recipiente está equipado con sondas para medir la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto y el nivel de espuma. Las balanzas indican los cambios de masa dentro de los tanques y del biorreactor.

Se pueden tomar muestras a través de una válvula de muestreo para el análisis fuera de línea de las concentraciones de sustrato y producto. Los controladores PID están disponibles para la temperatura, el pH y el nivel. El control PID del oxígeno disuelto se realizó en forma de cascada (velocidad del agitador, flujo de aire, flujo de oxígeno). La operación del biorreactor se lleva a cabo a través de una interfaz gráfica de usuario del sistema de control de procesos. El biorreactor puede operar en modo por lotes, alimentación continua (fed-batch) o continuo.

Publicado en Aquí El primer Simulador de Entrenamiento en Biorreactores

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Sistemas de Software para el Desarrollo de Modelos en biorreactores

El desarrollo de desarrollo de modelos en biorreactores es uno de los principales factores de costo en el desarrollo de simuladores de entrenamiento. Por lo tanto, se requieren herramientas de software potentes para apoyar la modelización, las cuales deben ofrecer la siguiente funcionalidad: 

- Solución numérica de sistemas de ecuaciones diferenciales no lineales con (integrados) sistemas de ecuaciones algebraicas no lineales 

- Algoritmos de estimación de parámetros 

- Representación gráfica de los resultados de la simulación 

- Entrada fácil de condiciones iniciales y valores de parámetros 

- Interfaz con otros sistemas de software, como sistemas de control de procesos 

- Interfaz con bibliotecas de modelos 

- Herramientas de documentación y mantenimiento

Por favor traduce a español el siguiente texto

Software Systems for Model Development

Sería deseable que el sistema permita la creación de bibliotecas de desarrollo de modelos en biorreactores. 

Las herramientas existentes para el desarrollo de simuladores de entrenamiento pueden agruparse en: (i) software para la solución numérica de sistemas de ecuaciones matemáticas, como Matlab/Simulink o WinErs, (ii) simuladores de ingeniería de procesos como Aspen o ChemCad, y (iii) paquetes de software basados en compiladores que utilizan bibliotecas matemáticas, como IMSL Numerical Libraries (Rogue Wave Software, Inc.), NAG Numerical Library, CERN Program Library, o Numerical Recipes. Además de estos, se han desarrollado algunos sistemas de software internos para el desarrollo de simuladores de entrenamiento. 

Todos estos sistemas permiten desarrollar modelos individuales que pueden vincularse a sistemas de control de procesos mediante interfaces apropiadas. Además, los simuladores de ingeniería de procesos ofrecen bibliotecas de modelos estacionarios y dinámicos listos para usar para varias operaciones unitarias. Los sistemas basados en compiladores ofrecen la mayor flexibilidad y transparencia para los desarrolladores de modelos, ya que no solo se conocen los modelos, sino también los algoritmos para su solución y estimación de parámetros. Los sistemas de software para la solución numérica de sistemas de ecuaciones matemáticas son fáciles de usar y requieren poco entrenamiento específico o conocimientos avanzados de programación para su uso.

Uso Múltiple de desarrollo de modelos en biorreactores.

Debido al alto esfuerzo requerido en la modelización, tiene sentido maximizar las aplicaciones de los modelos. Esto requiere una buena separación entre las propiedades específicas del proceso y las características generales en el modelo. Los modelos genéricos para subprocesos estándar u operaciones unitarias pueden resumirse fácilmente en bibliotecas de modelos. Estos también están disponibles comercialmente en las bibliotecas de los simuladores de ingeniería de procesos. 

Con frecuencia, los procesos contienen unidades de proceso específicas. Los modelos para estos procesos representan un conocimiento particular del propietario del proceso. Para construir una base de datos de conocimiento que contenga conocimiento en forma de modelos, se recomienda crear una biblioteca interna de modelos. Los modelos en esta biblioteca también pueden utilizarse internamente para diferentes propósitos, como los descritos en las secciones anteriores de este capítulo. 

Además, el conjunto de valores de los parámetros del modelo representa un conocimiento específico del proceso. También podrían formar parte de una biblioteca interna de modelos y deben ser descritos y documentados de manera adecuada. 

Los principales desafíos para el uso múltiple de modelos de procesos en biorreactores son su documentación y las interfaces entre diferentes modelos, bibliotecas de modelos y sistemas de software. Por esta razón, se han desarrollado estándares como CAPE-OPEN-LaRN, y deberían aplicarse siempre que sea posible. 

En esta sección, se presentan tres ejemplos de simuladores de entrenamiento con biorreactores: un simulador de entrenamiento de biorreactores para cultivos en suspensión de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadero) y Escherichia coli, un simulador de entrenamiento para el proceso de digestión anaeróbica y un simulador de entrenamiento para una planta piloto de bioetanol.

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Modelos estacionarios de biorreactores

Los modelos estacionarios de biorreactores son modelos invariantes en el tiempo. Desde el punto de vista de un simulador de entrenamiento, estos describen directamente las relaciones entrada-salida, principalmente en forma de ecuaciones algebraicas. Los modelos estacionarios de biorreactores se utilizan ventajosamente para describir las características de un proceso. 

Los modelos dinámicos describen la variación de las variables con el tiempo, a menudo en forma de sistemas de ecuaciones diferenciales. En los simuladores de entrenamiento, los modelos dinámicos suelen derivarse de principios fundamentales, como balances dinámicos de masa, energía o impulso. 

Por supuesto, también existen formas mixtas de modelos estacionarios de biorreactores. Ocasionalmente, también se utilizan modelos mecanicistas basados en principios fundamentales como modelos empíricos; por ejemplo, la estructura matemática de la cinética enzimática de Michaelis-Menten dentro del modelo de crecimiento de Monod. En el contexto de los simuladores de entrenamiento, puede ser apropiado usar modelos basados en primeros principios y combinarlos con funciones empíricas. Por ejemplo, se pueden utilizar funciones empíricas de respuesta al escalón para describir la transición dinámica de una variable de estado de un punto en una característica a otro debido al cambio en la variable de actuación. 

Los objetivos frecuentes de la modelización son: obtener comprensión de las relaciones causa-efecto, evoluciones temporales u órdenes de eventos; optimizar las estructuras de procesos, equipos y operaciones de procesos; así como apoyar la comunicación durante la planificación, gestión de proyectos y realización de proyectos; y, finalmente, la operación del proceso. 

Dentro de los simuladores de entrenamiento, los modelos matemáticos de procesos, como sistemas de ecuaciones algebraicas (no) lineales y ecuaciones diferenciales (no) lineales, forman la base para la simulación de procesos. Estos se combinan con otros tipos de modelos, como tablas de decisión o diagramas de flujo secuenciales (por ejemplo, para la realización de recetas). 

Existen diferentes submodelos para operaciones unitarias en ingeniería (bio)química, que describen: (i) microcinéticas (cinéticas de reacción bioquímica), (ii) macrocinéticas (procesos de transferencia de calor y masa), (iii) equilibrios de fase, (iv) balances de masa y energía, (v) reactores y equipos (por ejemplo, reactores continuos de tanque agitado o reactores de flujo pistón). Además, los datos de sustancias, datos de mezclas y datos de materiales de construcción forman una base fundamental para los modelos de simuladores de entrenamiento. Los simuladores de entrenamiento a menudo representan una planta completa, en lugar de una sola operación unitaria. Por lo tanto, deben destacarse otros dos niveles de modelado: (vi) el modelo de estructura de la planta, en el que las operaciones unitarias individuales están interconectadas entre sí, y (vii) el modelo del sistema de automatización y control de procesos.

Estrategia de Modelado

También para los simuladores de entrenamiento puede aplicarse una estrategia general para el desarrollo de modelos estacionarios de biorreactores. El desarrollo del modelo debe comenzar definiendo el sistema que se integrará en el simulador. Igualmente importante es la definición de los objetivos del modelado. En el caso de los simuladores de entrenamiento, se recomienda definir en esta fase los resultados esperados del entrenamiento y los escenarios deseables de formación. 

En la segunda fase, el proceso en cuestión debe describirse utilizando formas adecuadas de descripciones verbales y gráficas del proceso. Aquí se describen la estructura del proceso, principios fundamentales, así como relaciones causa-efecto, rangos operativos y secuencias operativas, posibles malfunciones, etc., según los objetivos definidos. 

La tercera fase comprende el modelado matemático. A menudo, ya existen modelos matemáticos para el sistema en cuestión. Por lo tanto, el modelado para simuladores de entrenamiento suele ser un proceso de búsqueda, selección, adaptación, modificación y extensión de modelos. Si no existe ningún modelo matemático adecuado, puede ser necesario formular un modelo completamente nuevo. 

Una vez que se ha seleccionado o formulado un modelo, este debe implementarse en un sistema de simulación. Posteriormente, el modelo debe parametrizarse de acuerdo con las dimensiones y características del proceso. Cabe señalar que los modelos de simuladores de entrenamiento de operadores suelen contener un número bastante alto de parámetros del modelo. En general, es imposible identificar estos parámetros únicamente a partir de datos originales del proceso o de experimentos o corridas de proceso específicamente diseñados. Sin embargo, los parámetros del modelo pueden derivarse de la geometría de las operaciones unitarias encontrada en la literatura o de información de bases de datos sobre propiedades de materiales y sustancias, parámetros cinéticos publicados y, en menor medida, de estimaciones de parámetros utilizando datos experimentales específicos del proceso. 

Debido a la falta de datos y la complejidad del modelo del simulador de entrenamiento, la validación y prueba del modelo a menudo es una combinación de verificaciones de plausibilidad y comparación de los resultados de la simulación con datos reales del proceso. Las pruebas del modelo del simulador en tanques de acero inoxidable deben cubrir todo el rango de condiciones operativas, incluso si no hay datos experimentales disponibles para todo el rango. Aunque una representación cuantitativa precisa del proceso puede no ser absolutamente necesaria, el modelo debe representar al menos las relaciones causa-efecto en un proceso de manera "cualitativamente correcta" y, por lo tanto, estar en consonancia con la descripción del proceso dada. 

El paso final y muy importante es la documentación del modelo y su implementación. Esta documentación es clave para la aplicabilidad del modelo, así como para su mantenimiento, desarrollo posterior y mejora, además de para su uso interno o externo adicional. La documentación es un requisito previo para prolongar el ciclo de vida de los modelos desarrollados. 

A diferencia de la mayoría de los modelos estacionarios de biorreactores publicados en la literatura científica, un simulador de entrenamiento completo para una planta biotecnológica se construye a partir de un número bastante grande de submodelos de operaciones unitarias con diferentes niveles de complejidad y subestructuras. La estrategia de modelado descrita es aplicable para cada submodelo por sí mismo, pero también para la combinación de submodelos para formar un modelo en el siguiente nivel.

Originalmente publicado Aquí Modelos estacionarios de biorreactores

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Costos en el modelado y simulación en biorreactores

Los costos en el modelado y simulación en biorreactores puede representar hasta el 50 % de los costos totales de desarrollo. Por lo tanto, el objetivo debería ser reducir significativamente estos costos. Este objetivo puede abordarse mediante mejoras en las áreas de (i) modelos y estrategias de modelado, (ii) sistemas de software para el desarrollo de modelos, (iii) estrategias de uso múltiple para modelos, actualización y intercambio mejorados de modelos, y bibliotecas de modelos. Además, se debe construir un simulador de entrenamiento utilizando herramientas eficientes para la calibración/parametrización de modelos y el desarrollo de modelos individuales altamente especializados.

Modelos de Procesos

Durante el desarrollo de simuladores de entrenamiento, se puede utilizar un amplio espectro de diferentes modelos para mitigar los costos en el modelado y simulación en biorreactores. En este texto, empleamos una definición bastante amplia del término "modelo": Un modelo es una representación abstracta o concreta de la realidad, que ilustra las relaciones, propiedades o secuencias de eventos relevantes de un sistema (técnico) (proceso, planta, instalación) con respecto a la utilización definida del modelo. 

Sin pretender ser exhaustivos, los siguientes tipos abstractos de modelos se utilizan en las diferentes fases de un proyecto de desarrollo de un simulador de entrenamiento: (i) descripciones verbales de procesos, (ii) gráficos para representar estructuras de procesos (por ejemplo, diagramas PI&D) y secuencias de procesos (por ejemplo, diagramas de flujo secuenciales), (iii) tablas (por ejemplo, tablas de decisión en control), (iv) varios tipos de modelos matemáticos, (v) algoritmos, (vi) sistemas expertos y (vii) programas informáticos. 

En el contexto de los costos en el modelado y simulación en biorreactores, los simuladores de entrenamiento, es útil definir los términos modelos descriptivos y prescriptivos, modelos empíricos y mecanicistas, así como modelos estacionarios y dinámicos, ya que todos estos modelos pueden ser utilizados de manera beneficiosa dentro de los simuladores de entrenamiento. 

Los modelos descriptivos describen un original existente mediante la reducción a las propiedades relevantes para un propósito específico.

Ejemplos de modelos descriptivos son los modelos de plantas 3D concretos o por computadora (a menudo reducidos en tamaño), que se utilizan para explicar la estructura del proceso a visitantes o nuevos empleados. Sin embargo, también algunos modelos matemáticos son modelos descriptivos, como los splines de interpolación ajustados a través de ciertos conjuntos de datos.

Modelos prescriptivos

Modelos prescriptivos describen un original planificado en forma de un proyecto de apoyo o planificación y realización de procesos. Ejemplos son los planos técnicos para construir una máquina o los diagramas P&ID para una planta planificada. 

Con respecto a los costos en el modelado y simulación en biorreactores y los procesos de ingeniería química, es relativamente fácil lograr un buen acuerdo entre los datos medidos y los modelos descriptivos, pero la extrapolación a nuevas condiciones de proceso es prácticamente imposible.

En contraste, los modelos prescriptivos se utilizan para ingeniería. A menudo están basados en principios fundamentales. Con modelos prescriptivos, es posible predecir nuevas condiciones de proceso. Sin embargo, un buen acuerdo entre el modelo y la realidad también requiere un esfuerzo significativo en el modelado. En diversas áreas de los simuladores de entrenamiento, se utilizan tanto modelos prescriptivos como descriptivos. 

Los modelos matemáticos a menudo se agrupan en modelos empíricos y mecanicistas, así como en modelos estacionarios y dinámicos. Los modelos matemáticos empíricos describen simplemente datos experimentales mediante estructuras matemáticas adecuadas, posiblemente sin ningún significado físico, biológico o químico.

Ejemplos de estos modelos son polinomios, splines o redes neuronales. Su fortaleza radica en su alta adaptabilidad a muchos conjuntos de datos, trayectorias y curvas mediante conjuntos adecuados de parámetros del modelo.

Su desventaja es su muy pobre capacidad predictiva y su uso limitado para comprender las relaciones causa-efecto y los mecanismos. Sin embargo, en los simuladores de entrenamiento, los modelos empíricos pueden ser utilizados con gran beneficio si los datos de entrenamiento existentes cubren todo el rango de condiciones operativas. 

Los modelos en biorreactores mecanicistas con tanques de acero inoxidable están basados en principios fundamentales y describen mecanismos físicos, biológicos o químicos, como la transferencia de calor o masa, la cinética bioquímica, etc. Su desventaja es que el modelado efectivo requiere un alto entendimiento de los mecanismos subyacentes a un proceso o operación unitaria en particular.

Además, la estimación de los parámetros del modelo puede resultar muy difícil, a menudo debido a la falta de datos apropiados. Las ventajas de los modelos mecanicistas son sus buenas capacidades predictivas, incluso en nuevos rangos de condiciones operativas.

También comprenden el conocimiento mecanicista de un proceso, y por lo tanto actúan como una base de conocimiento dentro de un simulador de entrenamiento y pueden ser utilizados, por lo tanto, para enseñanza y capacitación.

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Fases de simuladores de biorreactores

Las fases de simuladores de biorreactores son de una complejidad muy alta y debe realizarse de manera estructurada. Un proyecto de estas características puede dividirse en cinco fases principales. Cada una de ellas comprende diferentes tareas y culmina con un resultado bien definido.

En la fase de proyecto preliminar (fase 0), se llevan a cabo estudios de viabilidad, teniendo en cuenta las ideas generales sobre las aplicaciones y los objetivos de formación, el(los) lugar(es) donde se utilizará el simulador y su estructura general. También deben revisarse las herramientas que podrían utilizarse para el desarrollo, el cronograma, así como los posibles costos y beneficios (retorno de la inversión). El resultado de la fase preliminar suele ser un estudio de viabilidad, que sirve como base para la fase I del proyecto.

En la fase I de desarrollo de simuladores de biorreactores, se definen los requisitos para el simulador y se lleva a cabo la planificación básica. En esta etapa, se toman decisiones relacionadas con los objetivos definitivos de la capacitación, así como con el proceso que se va a simular. Se recomienda definir la estructura del simulador de entrenamiento de acuerdo con la sección anterior durante esta fase de planificación básica.

El principal resultado de la fase I debería ser un documento de especificaciones que incluya una descripción del proceso, diagramas de flujo del proceso, una buena descripción de los escenarios de capacitación, así como la definición de la estructura básica del simulador de entrenamiento.

También es útil definir una lista completa de las variables de estado de los biorreactores que se van a simular, así como una lista completa de las variables de control utilizadas para manipular el proceso. Finalmente, debe especificarse cuántas (al menos) gráficas deben mostrarse, si los datos históricos deben ser accesibles y cómo debería ser, en principio, la interfaz gráfica de usuario en las estaciones de monitoreo y control.

Durante la fase II del proyecto, se lleva a cabo la planificación detallada. Como resultado, toda la información necesaria para programar y construir el simulador debe estar disponible. Por lo tanto, es necesario definir en detalle la estructura del proceso, incluyendo todas las operaciones unitarias, actuadores, dispositivos de medición, variables de estado, lazos de control, etc.

Además, en las fases de simuladores de biorreactores debe especificarse la estructura y funcionalidad del sistema de automatización dentro del simulador. Es útil emplear diagramas de flujo secuenciales (SFC), que describan los principales procedimientos operativos, los cuales deben implementarse de acuerdo con los escenarios de capacitación y las operaciones estándar requeridas.

En la fase II, los escenarios de capacitación pueden revisarse o recibir una especificación más detallada. Una descripción detallada de las relaciones de causa y efecto dentro del proceso, así como los principios subyacentes en combinación con datos reales del proceso (al menos provenientes de experimentos a nivel de planta piloto), forman la base para el desarrollo del modelo del proceso. Finalmente, el modelo matemático del proceso debe desarrollarse a partir de la información proporcionada en la fase II del proyecto.

La fase II del proyecto de simuladores de biorreactores también se ocupa de la especificación de la estructura del propio simulador de capacitación y, por lo tanto, del hardware, interfaces y sistemas de software requeridos.

Aquí también en las fases de simuladores de biorreactores deben identificarse las herramientas de software necesarias. Los entregables sugeridos para la fase II del proyecto son: una descripción verbal del proceso, diagramas de flujo del proceso, diagramas P&ID (de tuberías e instrumentación), diagramas de flujo secuenciales para procedimientos estándar y de capacitación, escenarios de capacitación revisados y modelos matemáticos del proceso, así como una lista del hardware informático y las herramientas de software necesarias para la realización del simulador de capacitación. Finalmente, debe entregarse un cronograma de realización para la fase III del proyecto.

En la fase III de desarrollo de simuladores de biorreactores (realización y puesta en marcha), se construye, prueba, pone en marcha y entrega el simulador de capacitación para su uso por parte del cliente. Elementos importantes de esta fase son la programación de los modelos matemáticos, la implementación de la automatización y las interfaces gráficas de usuario en las estaciones de monitoreo y control, la implementación del hardware y las pruebas del simulador. Los escenarios de capacitación se prueban y finalizan, y se redacta la documentación del sistema. Finalmente, se realiza la puesta en marcha del simulador y se capacita al cliente para utilizarlo.

La importancia en las fases de simuladores de biorreactores de una post-fase de proyecto bien organizada (fase IV - operación y mantenimiento del sistema) en el ciclo de vida de los simuladores puede ser subestimada. En esta fase se lleva a cabo el mantenimiento del sistema, revisiones, mejoras y adaptaciones a estructuras de planta modificadas; además, se capacita a nuevos miembros del personal en el uso y mantenimiento del simulador. Además, los escenarios de capacitación pueden adaptarse a las necesidades actuales de la empresa, lo que a su vez podría requerir una adaptación adicional del simulador de capacitación.

Originalmente publicado Aquí Fases de simuladores de biorreactores

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Simuladores de Entrenamiento para Biorreactores

Optimizando el Inicio de Plantas Aplicaciones Clave y Requisitos

Cuando se trata de poner en marcha una nueva planta o proceso, especialmente en instalaciones que emplean biorreactores, la preparación lo es todo. Los simuladores de entrenamiento, también conocidos como Simuladores de Entrenamiento para Operadores (OTS, por sus siglas en inglés), han revolucionado la manera en que las industrias biotecnológicas abordan el manejo de procesos complejos, las pruebas de automatización y el desarrollo de estrategias de control para procesos biológicos. Entrenamiento para biorreactores es clave para asegurar que los operadores comprendan la dinámica de estos sistemas y se adapten rápidamente a los desafíos que presentan.

Entrenamiento Antes de la Puesta en Marcha de Biorreactores Uno de los usos más valiosos de los simuladores de entrenamiento es preparar a los operadores antes de que un biorreactor entre en operación. A través de los OTS, los operadores pueden practicar operaciones estándar, como inoculación, control de parámetros clave (pH, temperatura, oxígeno disuelto) y manejo de cultivos biológicos, en un entorno simulado. Este entrenamiento no solo aumenta la familiaridad con las características específicas del proceso biotecnológico y los sistemas de control, sino que también reduce el tiempo necesario para poner en marcha un biorreactor de manera segura y productiva. Además, el entrenamiento para biorreactores permite que los operadores anticipen posibles escenarios críticos y actúen de manera proactiva.

Sin embargo, crear estos simuladores puede ser un desafío debido a la complejidad inherente de los procesos biológicos. Durante el desarrollo, a menudo existe una cantidad limitada de datos confiables sobre el comportamiento de microorganismos o sistemas en distintas condiciones operativas. Los desarrolladores deben integrar principios fundamentales de biotecnología y modelos mecanísticos para estimar con precisión el desempeño del biorreactor.

Simplificación del Diseño y Ajuste de Controladores en Biorreactores Los simuladores de entrenamiento también respaldan el diseño y ajuste de sistemas de control específicos para biorreactores. Estos requieren una precisión significativa al modelar procesos dinámicos como la tasa de crecimiento celular, el consumo de sustratos y la producción de metabolitos. Entrenamiento para biorreactores con estos simuladores asegura que los operadores y los ingenieros puedan:

Demostrar controladores adaptativos diseñados para condiciones biológicas variables.

Familiarizarse con estrategias de control específicas, como el control por retroalimentación para oxígeno disuelto.

Usar interfaces que imiten sistemas reales de control, como SCADA o DCS, ajustados a procesos biotecnológicos.

Este enfoque asegura que las estrategias de control sean implementadas de manera efectiva en entornos que demandan alta precisión operativa.

Pruebas Confiables de Sistemas de Automatización en Biorreactores La versatilidad de los OTS para biorreactores se extiende a las pruebas de sistemas de automatización. Al conectar el simulador con sistemas de automatización mediante interfaces de E/S adecuadas, los ingenieros pueden simular el monitoreo y control en tiempo real de parámetros biológicos críticos. Esto permite:

Probar la funcionalidad básica de sensores específicos de biorreactores, como analizadores en línea de gases.

Simular condiciones reales de operación, incluyendo variaciones en la concentración de nutrientes o contaminaciones hipotéticas.

Mejorar la confiabilidad de los sistemas de control de procesos en biorreactores.

Entrenamiento para biorreactores en este contexto no solo mejora la preparación técnica, sino que también reduce los riesgos asociados con la operación en condiciones reales.

Desarrollo de Estrategias de Control y Optimización de Procesos Biotecnológicos Para aplicaciones avanzadas, los simuladores de entrenamiento se utilizan en el desarrollo y la validación de estrategias de control biotecnológico. Mediante modelos mecanísticos que incluyen cinéticas de crecimiento celular y dinámicas de transferencia de masa, los simuladores permiten:

Interactuar con controladores para ajustar dinámicamente las condiciones del biorreactor.

Probar y refinar secuencias operativas, como ciclos de alimentación o purga.

Experimentar con procedimientos de escalado para garantizar una transición exitosa de laboratorio a producción industrial.

Por ejemplo, simuladores especializados han sido utilizados para optimizar la producción de biofármacos y biocombustibles, como el bioetanol, demostrando su potencial en procesos basados en biorreactores.

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