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[spockeveryday]

[akirasouchan]

The Ultimate Guide to Real Estate Acquiring: Whatever You Need to Know

Are you considering going into the property market as a purchaser? Whether you're a novice homebuyer or an experienced capitalist, the procedure of acquiring genuine estate can be both amazing and complicated. With a lot of elements to take into consideration and decisions to make, it's critical to have a clear understanding of the actual estate buying process to ensure a smooth and effective deal. In this thorough guide, we will certainly walk you via whatever you need to find out about acquiring realty, from recognizing the market to securing funding and shutting the deal.Paragraph 2: One

of the very first steps in the realty buying process is investigating and recognizing the market. This consists of analyzing existing market trends, examining residential or commercial property values, and identifying potential locations. We will supply you with expert tips on just how to browse the market and locate the finest opportunities that straighten with your requirements and budget. Furthermore, we will certainly cover the significance of getting pre-approved for a home mortgage and just how to choose the right lender for your financing requires. We will certainly likewise look into the arrangement process, aiding you comprehend just how to make affordable offers and bargain terms that function in your support. From assessments to evaluation, we will certainly lead you through the due diligence process and lay out the essential actions required to seal the deal effectively. By the end of this overview, you'll have the knowledge and self-confidence to browse the property buying procedure with convenience and make educated choices that align with your goals.

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[izzy-lee]

The Ultimate Guide to Real Estate Buying: Whatever You Need to Know

Are you considering getting in the actual estate market as a buyer? Whether you're a first-time property buyer or an experienced financier, the procedure of getting realty can be both interesting and daunting. With so numerous aspects to think about and choices to make, it's essential to have a clear understanding of the realty purchasing process to make certain a smooth and effective purchase. In this detailed guide, we will certainly stroll you through whatever you require to understand about acquiring real estate, from recognizing the market to protecting financing and closing the deal.Paragraph 2: One

of the primary steps in the property buying procedure is researching and comprehending the marketplace. This consists of analyzing existing market fads, examining residential property values, and identifying potential places. We will certainly offer you with expert ideas on how to navigate the marketplace and find the most effective possibilities that align with your requirements and budget. In addition, we will certainly cover the significance of obtaining pre-approved for a home loan and how to pick the right lending institution for your financing needs. We will certainly likewise delve into the settlement procedure, helping you comprehend exactly how to make competitive offers and bargain terms that work in your support. From evaluations to assessment, we will lead you through the due persistance procedure and describe the crucial steps needed to seal the deal efficiently. By the end of this overview, you'll have the knowledge and confidence to navigate the realty acquiring procedure effortlessly and make informed choices that align with your objectives.

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A.E Business Brokers

Making the decision to sell your business is pivotal. Entrust A. E. Business Brokers to navigate this crucial process for you. With our commitment to maximizing market value and honoring your exit goals, we ensure a seamless transition. Take advantage of our free business appraisal by contacting us at +1 617-9821-870 or clicking the orange button on our website https://www.aeconf.net for a no-obligation consultation.

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Journal Entry #77 - Massachusetts Tries to Charge the Same Crime as New York, but no victim, No Five (5) W's - Who, What, When, Why, Where and How, No Restraining or Protective Orders…But Did Some Eastern Housing Court and Massachusetts State Police backhanded sht. Massachusetts did not speak to South Carolina, Georgia, Washington, DC, or Maryland on what the physical side of me does on Bullsht.

JOURNAL ENTRY #77 Name: Manley M Collins Social Security Number: 5 7 9 – * * – 6 5 4 1 Date of Birth: 06/21 Place of Birth: Washington, District of Columbia Country of Birth: United States of America Date: January 1, 2024

TOPIC: Massachusetts Tries to Charge the Same Crime as New York, but no victim, No Five (5) W's - Who, What, When, Why, Where and How, No Restraining or Protective Orders…But Did Some Eastern Housing Court and Massachusetts State Police backhanded sht. Massachusetts did not speak to South Carolina, Georgia, Washington, DC, or Maryland on what the physical side of me does on Bullsht.

Caucasian, European White Male State Trooper does me the African-American black guy…systemic racism.

Referral for Public Defender Criminal Justice Institute at Harvard University - 6174968143 Stated Not Picking up any more caseload because of the end of the year.

Harvard Defenders 6174954413 Called before and spoke with male who made it seems like they were going to represent me.

I called about my arraignment notice and they gave me referrals, and mentioned they needed to be at the original hearing.

Also, they stated to go to the Boston Municipal Court Clerk's office and request to be appointed a public defender.

Committee for Public Counsel Services website 6174826212 Gave the best advice to answer the judge question requesting a public defender - Answer the question - Yes

Out of 47+ of my civil or criminal cases, I was never asked by a judge or clerk regarding my personal details of a vacation or anyday to set a court date. Eastern Housing Court personnel went outside their job responsiblities when a court date landed on my South Carolina vacation. Here is the letter addressed to the clerk. I also sent internal and external complaints for every police report I filed and the one the state trooper filed. The application and complaint is coming out of Boston Municipal Court at 24 New Chardon Street, 6th Floor, Boston, MA 02114. No US Mail envelope or email receipt was not produced on how the State Trooper got the Motion of Continuance without my personal details.

Boston Police Detective Keith P. Kaplan mentioned I can use any colorful language including profanity for self-defense, just no active shooter content given the current environment. Boston Police Officer Natasha Lajara agreed and talked with me also.

I was able to send approximately twenty (20) criminal applications back to Massachusetts on the people and organizations that did me since August 2020. It feels real good for therapy in handling my issues. I also sent a big civil case involving the federal, state, and city government for the incident.

My adrenaline is very high daily and I am pushing more weight than my personal record. I spent New Year's Eve and New Year's Day all day workouts and sore as hell.

198 Tremont St Suite 335 Boston, MA 02116 USA

Friday, November 17, 2023

Alex Valderrama Clerk of Eastern Housing Court of Massachusetts Edward W. Brooke Courthouse 24 New Chardon Street 3rd Floor Boston, MA 02114 USA

Dear Mr. Valderrama,

It was a pleasure speaking with you today, 11/17/2023 approximately 10:00 am. I am the African-American male that is a part of Collins vs SplitSpot case and Collins vs Pine Street Inn case.

The issue is with the Collins vs SplitSpot case. I was speaking with a latino woman regarding the case. The case had hearing dates. I have not been getting all the notifications on the case. The October 2023 hearing mailed to me, but no information on date being change. The November 2023 date was issued on my personal vacation week. I came in person on October 2023 hearing date thinking it was a hearing. The latino woman informed me the hearing was moved to November 2023. I informed the latino woman November 2023 date falls on my personal vacation or I will be out-of-town. The latino woman asked for a written Motion of Continuance. The latino woman illegally asked for personal information about the personal vacation to submit with my Motion of Continuance. I told her, “No.” I do not want to provide that information. [HINDSIGHT/HIDDEN THOUGHT: Post traumatic stress disorder and schizophrenia from New York City incident.] However, the latino woman said she would follow up with a phone call or approval letter from the Judge. A whole week and a half went by with no phone call or letter follow up before my approaching vacation. Thus, out of anger, I submitted an electronic copy of Motion of Continuance with consequences if my personal information is misused in any way reflecting back to New York City incident. I have physically purchased my Paris 2024 Olympic tickets, waiting for my volunteer to Paris 2024 Olympic games application results, have obtained my United States passport, reserved my French lodging, and purchased my AirFrance tickets from Boston Logan to Charles De Gaulle airport.

Massachusetts repeated the same situation just like the New York City incident. Someone from your office extracted from the electronic Motion of Continuance’s only the portion with the consequence of wrongful misuse of my personal information and sent it the Massachusetts State Trooper Joseph A. Middleton, #1544 (250 Leverett Circle, Boston, MA 02114) on October 5, 2023. An application for Criminal Complaint was made by Boston Municipal Court. I had the initial hearing today, November 17, 2023 at 9 am.

Yesterday, November 16, 2023, I spoke with a white male Caucasian about the incident and requested how to make a grievance, and “Was it in their job responsibilities to ask for personal information to change a court hearing date?” Friday, November 17, 2023, I spoke with you for more details.

Your question: “Whether I want you to respond and how to resolve this?” Since the cop Joseph A. Middleton, State Trooper #1544 (250 Leverett Circle, Boston, MA 02114) is taking the fall. I want you to respond via phone call to me at (617) 955-0689 with a written letter follow up to 198 Tremont St, Suite 335, Boston, MA 02116 USA.

How to resolve this: While my application for felony threat to commit a crime is being processed, then I want the latino woman on administrative leave with pay.

My next hearing is January 4, 2024 in front of a judge, if my case goes public and the charge becomes public costing me all my freedoms, independence, Paris 2024 Olympics and relocation to France, my employment opportunities, public assistance benefits, housing opportunities, educational opportunities along with already obtained four business degrees, and everything else, then I am requesting the latino woman to be fully terminated without benefits and severance pay.

I still have the housing cases to proceed with, but please make sure she avoids me at all costs. I have no problem requesting someone else like I did today. Please do not share any additional personal details with the latino woman or anyone outside this letter other than your supervisor, director, attorney general, or mayor. Thanks for your attention to this matter. Looking forward to hearing from you and your team.

Regards, Dr. Manley M. Collins, BS, MS, MBA, DM/PhD Plaintiff Pro Se (617) 955-0689

The application, police report, and incident report filed by the Massachusetts State Trooper #1544 can be seen by clicking here. https://drive.google.com/file/d/1E3RKin3txDFmVW1YY0IG5CX8wo5lHsmo/view?usp=sharing

The summons can be seen by clicking here. https://drive.google.com/file/d/1wci6fUQs6WLjVggdYfJdSiIICsMcrXyc/view?usp=sharing

The civil lawsuit can be seen by clicking here. https://drive.google.com/file/d/11_zhdlsc_03lrViDi_Ka8l0kmbsl5qED/view?usp=sharing

Attended the French Library / Alliance Française of Boston and Cambridge Member's Party. I am proud to be a member. I am glad to have met the director and new people.

Attended the French Library / Alliance Française of Boston and Cambridge Marche de Noel.

Attended the French Library / Alliance Française of Boston and Cambridge Online Conversation Club.

Happy Thanksgiving. New item - Zero Sugar Strawberry Icing Yellow Cake.

Had Zumba at La Vie at Millennium Place in Boston, Massachusetts

I met my BCBS new primary care physician at Boston Medical Center. I got my Monobivalent COVID-19 booster and tested for HIV/STD panel. I also got refills on my medications, Banophen, Zyprexa, and Truvada. I met the preceptor over the resident doctor. I went back to BMC Psychiatry to attempt to re-establish care. Unfortunately, after six months or more disconnect, I have to get a referral from my PCP. My BMC BCBS PCP mentioned Psychology Today was a good resource for therapists. I did make the recommended two or three calls to connect with a therapist or psychologist in my area. My initial HIV test came out negative - HIV Ag/Ab Combined Qualitative - Result Non-Reactive. My basic metabolic panel came out on the normal ranges. My Calcium was 9.3 mg/dl (normal range 8-10.5 mg/dl). My CO2 was 22.0 mmol/l (normal range 19-28 mmol/l). My Chloride was 108 mmol/l (normal range 98-110 mmol/l). My Glucose was 85 mg/dl (normal range 70-100 mg/dl). My Potassium was 4.3 mmol/l (normal range 3.1-5.3 mmol/l). My Sodium was 136 mmol/l (normal range 135-145 mmol/l). My Urea Nitrogen (BUN) was 10 mg/dl (normal range 7-25 mg/dl). My Creatinine was 0.95 mg/dl (normal range is 0.7-1.3 mg/dl). My Estimated GFR value was >90 mL/min/1.73_m2 (normal value >59 mL/min/1.73_m2). My anion gap without potassium was 6 (normal range is 7-16). I weighed 171 lbs (77.8 kg) with all my layered clothing on. My blood pressure was 115/74. My body mass index is 27.71. My temperature is 97.6 F (36.4 Celsius). My oxygen saturation is 99%. My pulse is 51.

GymIt had the special needs people clean the equipment or gym areas under supervision. It is a neat idea to employ or utilize the mental and physically challenged.

CVS Pharmacy is fantastic as usual with my refills and those variety of coupons keep me in the store.

General Motors is fighting back and forth to clear its name in the Collins vs Kyambade et al., case.

Christmas and Kwanzaa was nice at my AirBnb for the winter. My superhost was amazing and surprising me on AirBnb features and highly physically active in his 70s. We had discussions regarding on Boston's real estate, eating and drinking the best foods to stay healthy, giving wars, our family history, providing boundaries and space, having meals together, similar train of thought that family can be the people currently physically surrounding us, house chores, and house rules. I am so surprised that it took four years after and during all the fighting, and at the time I am leaving that the Greater Boston area decides to show hospitality from a Harvard graduate/alumnus.

South Carolina Vacation

South Carolina State University Bulldogs Die Hard Supportive Fans was sitting, and weathering the cold and rain, and watching the SCSU Bulldogs 17 vs Morgan State 20 last home game. I stayed all four quarters. It was Band Day and Buddy Pough Day. I still took my photos in the rain and frozen hands. I ate a chili and cheese hot dog and did a special request to add jalapenos. Belcher Hall is the School of Business and where I graduated with a Bachelor of Science in Agribusiness. I also pledged Phi Beta Lambda Business Fraternity.

South Carolina State University Meet and Greet Alumni Event started without a hitch and on time. Great location and venue. SCSU Alumni Relations planned a very good event. I had a good time getting to know some of the alums and fraternity brothers. The DJ was jamming. The bartender was doing the drinks…you might get a little tipsy. I only had cranberry-orange juice. I can't do alcohol. Thanks, SCSU Alumni Relations. I tried to watch the SCSUNAA Alumni Stellar Calendar event on FaceBook, but disconnected since I am not in it. Good times traveling down Russell Street and down US 301 to try to see Cross High versus Allendale-Fairfax High School - SC High School Football Playoffs.

The day and the life of a substitute teacher. I had 1st, 2nd, 4th, and 9th through 12th. Thanks for the opportunities - Reeves Elementary, Beech Hill Elementary, Sand Hill Elementary, Newington Elementary, and Ashley Ridge High. I learned some new methods on managing kids, getting work out of them, build in positive reinforcement, and masking punishment. For the younger kids, the emoji stick 😐 😐 face destroys their whole world if they do not get a smiley face at the end of the day. For older teens, the importance of respecting a substitute teacher when over 50% of the class decides to use the restroom, go to office, go to media center, or recover a lost item. I was happy to start introducing a one-by-one concept of line and numbering each of them.

Spent quality time with a dear friend Darron Denmark . You really do not know someone unless you physically and literally spend time with them. Good times…parallel lives and three intersections…two in Atlanta, Georgia and one in Columbia, SC. Thanks for your service, Mr. Denmark. Much love ❤️🥰🖤💚, my strong brother.

South Carolina State University Homecoming Week 2023 is in the books. The football game was a nail biter to the end - SCSU 27 vs Howard 24. The SCSU Marching 101 band was larger and played beautifully. The guest band Jonesboro Georgia High School Marching Band. The scoreboard played nice and loud. ESPN got the HBCU show of a great time. The classic chants played, old school music, and new school music played throughout the entire time at the game. The cheerleaders had great spirit and large group, but it was a shame to remain only on one side or section when the past cheerleader groups took school spirit on all appropriate sections. I visited Beta Delta of Alpha Phi Alpha Fraternity, Inc. tailgate tent and ran into Ogunna and Pugh, and met a new brother Wes, and saw Terry Holmes. I never reached SCSU Track and Field tailgate. I ran into more classmates and good peoples. I attempted to get a photo with The Honorable James Clyburn. The Clyburn cameraman could not take the photo on a smartphone after two tries, but I got to shake his hand and see him in person after 28 years when I personally visited his office in Washington, DC in 1995. For President Conyers, I shook his hand, but he did not know me so I can understand brushing off someone you do not know or heard of in taking a photo. Bulldogs on the Run was a great success and running into my Freshman year roommate and classmate, Andrew Lawton and my SCSU track and field teammates, Linnell Cooper and Donald Cooper, and the family. I ate my first Lawton's Chicken Sausage biscuit I came in 5th in my age group for Bulldogs on the Run. Thanks Nike+ for the encouragement per mile. It was my very first outside run in the cold since SCSU Men's Track and Field practices. Coach Jeffries gave me my 30 second conversation and a cherished photo. It was good for my mental health with all the love, excitement, and laughter shared among my peoples. I ran into Mrs. Heyward, Cross High Librarian, and a Ravenell brother from Pineville, South Carolina. I found Planet Fitness and walked through the Prince of Orange Mall.

Another eventful day at SCSU Homecoming. I picked up my race packet for Bulldogs on the Run from some classmates. It was good getting some Randolph Italian Ice. I went on campus of South Carolina State University to check out the student center and student plaza. I captured some of the memories of The Dungeon in Dukes Gymnasium from 5am and 6am gym workout for SCSU Track and Field. I saw a women's volleyball game going on in Dukes Gymnasium. I took some photos of the Whittaker Library and Alpha Phi Alpha shrine. My last event was the SCSU S.T.A.T.E. Club Fish Fry Cookout on Felton Field.

It has been 25 years stepping back into Smith-Hammond-Middleton Memorial Arena on the campus of South Carolina State University. Quite a few physical changes to the campus. Congratulations to New tradition of Mister South Carolina State University and the long time standing tradition of Miss South Carolina State University. A flood of memories of giving speeches, sport games, classes, and dancing at that facility. Miss SCSU JaMelia Baylor-Stroud, Sam Hinton, and I chuckled over the good times and kept critiquing our generation versus today's generation. Beta Delta of Alpha Phi Alpha Fraternity, Inc. started the stepping or stroll to the current theme song. They were lit. Go Bulldogs! 1896. Congratulations to all the Kings and Queens, and their supporters.

One major change is the tailgating has gotten so big that I missed the social component. JaMelia did call and ask where was I while I was driving back to my hotel, but the old times when SCSU had a game, the day just ended with the game and I thought everyone just pack up and gone home. This was not the case. A definite lesson learned from SCSU Homecoming.

I went to HearUSA as a part of a contractual benefit with Blue Cross Blue Shield of Massachusetts. When healthcare insurance provides hearing screening as a benefit…wow! Thank God I still can hear after all the loud noises from warehouse work, partying and nightclub, family and friends arguments, EMS and anything with a siren. No raising hands to say I can hear, I have to yell out the words from inside sound box.

I went to Studio Optics for my second vision examine. We, the doctor and I, went through the various glasses. I made my selection and order, but the doctor is simply waiting for payment to place the order.

I renewed my membership with USA Track and Field Association and Potomac Valley Track Club.

The United States Department of Defense (Department of the Navy) closed the federal tort claim and stated to sue in the federal court.

I had my Boston Housing Authority Public Housing final interview. Rosanna Ramirez stated they needed more information and updated information to state I am eligible for public housing. I sent them Citibank information because they were apart of the problem. I sent them a 110 page legal document showing my housing for the past 2.5 years and everything that happened. I stopped showing any income. I signed a release of information document for Massachusetts Department of Transitional Assistance and Pine Street Inn. The young lady still requesting up-to-date banking, income, and housing information. I asked her, "Who is seeing all these documents or show me the information system this information is going in?" She lied and said, "Only her and her supervisor." Tell me I am crazy for sending all my personal and professional information to the fourth BHA employee. I do not know where my information is stored or being sent. The property is not brand new, no amentities, no assurance of security, none of BHA is my friends or family, and still have to pay some type of rent on a sliding scale. None of the information from previous interviews and request for information was not even mentioned.

SplitSpot settled their side of the lawsuit for $1400, which is less than what I gave them. I told Ernesto Gaxha to not pull an AT&T situation, which is AT&T went bankrupt, kept the name, and rise as a new company with same name. Ernesto Gaxha, the President and CEO, of SplitSpot gave me courtesy call because the company went bankrupt and riddled in debt, and was bought by another company.

I had my SplitSpot case hearing, which is left with the roommates and the insurance company. I stood my ground and stated, "I oppose the Motion to Dismiss and hold all allegations true to each one of them."

I submitted my United States Department of Education's Total and Permanent Disability Application to discharge my student loans held by Nelnet.

I finally started my new group exercise instructor position at Boston Sports Club/New York Sports Club/Town Sports International. I had my first Zumba class. I shadowed another instructor for Total Body Conditioning. The group exercise manager mentioned needed Les Mills BodyPump instructors. I am torn because my goal was BodyCombat, but the gym wants BodyPump. I am practicing my second full routine of Zumba.

I like the Blue Cross Blue Shield referral request system on HMO plans. I finally understand how it works.

I followed the Paris 2024 Volunteer Instagram. I got a response to volunteer application and got accepted for the 2024 Paris, France Olympics and Paralympics.

I joined a Zoom call with the Alpha Chapter of Alpha Phi Alpha Fraternity, Inc. regarding the Alpha Light Fund and Alpha House being built in Ithaca, New York.

With data breaches, a company called WellTok informed of Massachusetts General Hospital (MGH) data breach. As a part of proactivity, they offered and I signed up for the Experian IdentityWorks product and service.

I got rejected or turned down by Paris 2024 employment staff, it seems in part with Randstad of France. I guess it was because I was not legally authorized to work in France without living there.

I had to process plenty of US mail when I returned from my South Carolina vacation.

I am responding to all the motions to dismiss, which taking plenty of time.

I am still getting most of my physical workouts in for stress and anger management.

December 16th was a decent day until a tall and large kid that do not run the 200m dash trips and rolled right in my lane 2. My final time was 29s, when I was on pace for 26s chasing kids down. The TRACK at New Balance USATF New England Indoor Season Opener never a dull moment.

December 26th was okay at the New Balance USATF Night at the Track. I registered and ran the 60m like I stated my time 8.82s. I was bloated with food, fruit, and drink. My body must think it is still on vacation…the pounds are trying to creep back on. I had to set my alarms again to begin waking up at 5:30 AM EST.

December Holidays and Awareness

Happy World AIDS Day, Happy Hanukkah, Happy International Volunteer Day, Happy New Year's Eve, Happy Kwanzaa, Merry Christmas, Happy Christmas Eve, Happy Human Rights Day, Happy Bill of Rights Day, Happy International Day of Persons with Disabilities, Happy HIV/AIDS Awareness Month, Happy Worldwide Food Service Safety Month, Happy Write a Friend Month

November Holidays and Awareness

Happy Diwali, Happy Bhai Dooj, Happy World Kindness Day, Happy National Pickle Day, Happy All Saints' Day, Happy All Souls' Day, Happy Election Day, Happy Marine Corps Birthday, Happy Veterans Day, Happy Thanksgiving Day, Happy Black Friday Day, Happy Cyber Monday Day, Happy Giving Tuesday, Happy National Adoption Month, Happy American Diabetes Month, Happy Lung Cancer Awareness Month, Happy Vegan Month

Top Ten (10) Personal Music Playlists

Teddy's Jam - Guy

Mi EXXX - Wisin and Anuel AA

Let It Snow - Boyz II Men

Rockin' Around the Christmas Tree - Brenda Lee

About Damn Time - Lizzo

I Get Lifted (Go to Church) - Barbara Tucker

Get Money - Junior M.A.F.I.A.

Tom's Diner - Suzanne Vega, DNA

Bugatti - Ace Hood

Long As I Got King Jesus - Vickie Winans

[howlingscience]

Necessary Tips for a Smooth Real Estate Purchasing Experience

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Acquiring a residential or commercial property is commonly among the most significant economic transactions individuals undertake in their lifetime. Whether you are a new buyer or a seasoned financier, browsing the actual estate market can be an overwhelming job. Nonetheless, with the appropriate expertise and prep work, you can ensure a smooth and successful purchasing experience. In this blog article, we will discuss some necessary ideas that can aid you make educated decisions and protect the residential or commercial property of your dreams.The initial step in

the property acquiring procedure is establishing a clear spending plan. Determine just how much you can manage by very carefully evaluating your financial situation, including your earnings, existing financial obligations, and credit history. Setting a realistic spending plan will assist you tighten down your alternatives and stay clear of falling for residential properties outside your price range. Additionally, it is crucial to get pre-approved for a home loan before starting your residential or commercial property search. This step not only offers you a clear understanding of just how much you can obtain but likewise makes you a much more attractive customer to sellers. By being pre-approved, you can move promptly when you discover the ideal building, boosting the possibility of a successful purchase. Remain tuned for much more useful suggestions on browsing the genuine estate market and making the most effective choices when it involves acquiring building.

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Vital Tips for a Smooth Property Purchasing Experience

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Buying a residential property is typically among the most considerable financial purchases people take on in their life time. Whether you are a newbie homebuyer or an experienced financier, browsing the realty market can be a complicated task. Nevertheless, with the appropriate knowledge and prep work, you can ensure a smooth and successful buying experience. In this article, we will review some necessary pointers that can aid you make informed decisions and safeguard the building of your dreams.The very first step in

the property purchasing procedure is establishing a clear budget plan. Determine just how much you can manage by very carefully assessing your economic circumstance, including your income, existing financial debts, and credit report. Setting a reasonable spending plan will aid you narrow down your alternatives and prevent loving homes outside your price variety. Additionally, it is essential to get pre-approved for a home mortgage prior to starting your building search. This action not only provides you a clear understanding of just how much you can borrow yet also makes you a more attractive customer to sellers. By being pre-approved, you can move swiftly when you find the excellent residential or commercial property, enhancing the likelihood of an effective acquisition. Remain tuned for better tips on browsing the property market and making the best choices when it comes to purchasing building.

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The Ultimate Guide to Real Estate Buying: Everything You Need to Know

Are you considering entering the realty market as a purchaser? Whether you're a novice buyer or a seasoned capitalist, the process of buying realty can be both exciting and daunting. With a lot of elements to consider and choices to make, it's vital to have a clear understanding of the realty buying procedure to guarantee a smooth and effective purchase. In this extensive guide, we will stroll you via whatever you need to learn about purchasing genuine estate, from recognizing the market to securing financing and shutting the deal.Paragraph 2: One

of the very first steps in the genuine estate buying process is researching and recognizing the marketplace. This includes assessing existing market trends, studying building values, and determining prospective places. We will certainly provide you with professional pointers on how to navigate the marketplace and discover the most effective opportunities that straighten with your needs and spending plan. Additionally, we will certainly cover the relevance of getting pre-approved for a home mortgage and exactly how to select the ideal lender for your financing requires. We will likewise delve right into the arrangement process, aiding you understand how to make competitive deals and bargain terms that function in your support. From inspections to evaluation, we will certainly assist you with the due persistance procedure and detail the essential steps called for to seal the deal effectively. By the end of this overview, you'll have the expertise and confidence to browse the property buying procedure effortlessly and make notified decisions that line up with your goals.

Read more here Ford Realty Inc 137 Charles St, Boston, MA 02114 617 720 5454

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24 HR Emergency Plumber Boston Inc

As a 24 HR emergency plumber Boston, we provide the full range of plumbing services you need to keep your home or business functioning efficiently. Don’t hesitate to call us to address all your plumbing needs. We are a legally licensed and fully insured plumbing company, and every person on our team has passed extensive background checks. We also stay up to date on the latest plumbing technology and procedures, ensuring our plumbers are thoroughly trained to handle any plumbing issue that might arise. We strive to provide superior customer service and the highest quality in plumbing system care. Call us today to schedule an appointment or to request immediate emergency service any time of the day or night.

Address: 31 Phillips St #2, Boston, MA 02114

Phone: 617-356-0651

Website:24 HR Emergency Plumber Boston Inc

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Shoe on a Palm：02114 “BALENCIAGA” Space Shoe in Silver（SS2022） illustration by Jumpei Kawamura

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Business Name: Kind Heart Solar Solutions

Address: 59 Bowker St, Boston, MA 02114

Business Email: brandon@solar-boston.co

Phone: 508-466-5978

Description: The Best Solar Panel Installation Boston MA Has To Offer! Our team is very experience in handling the Boston solar panels that locals have come to love and rely on. We can tackle anything from residential to commercial installations - we have the skills to do it all! Not only provide the new solar panel installation Boston MA needs, we can also repair or maintain your current solar panels. Having solar on your home is the way of the future and it is an economic and environmentally friendly way to keep your home running. Our company offers you skilled workmanship and the best quality materials for all of our projects. Call today and find out why we are one of the top solar companies Boston has to offer!

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Herpes Zoster: Persistent Increased Risk of Cardiac Event or Stroke After Shingles

MedicalResearch.com Interview with:|

Dr. Curhan Sharon G. Curhan, MD, ScM| Director, CHEARS: The Conservation of Hearing Study Channing Division of Network Medicine Department of Medicine Brigham and Women’s Hospital Harvard Medical School Boston, MA 02114 MedicalResearch.com: What is the background for this study? Response:       Herpes zoster, commonly known as “shingles,” is a viral infection that often causes a painful rash. Shingles can occur anywhere on the head or body. Shingles is caused by the varicella zoster virus (VZV), the same virus that causes chickenpox. After a person has chickenpox, the virus stays in their body for the rest of their life. Years and even decades later, the virus may reactivate as shingles. Almost all individuals age 50 years and older in the US have been infected with the varicella zoster virus and therefore they are at risk for shingles. About 1 in 3 people will develop shingles during their lifetime, and since age is a risk factor for shingles, this number may increase as the population ages. The risk is also higher among individuals of any age who are immunocompromised due to disease or treatment. A number of serious complications can occur when a person develops shingles, such as post-herpetic neuralgia (long-lasting pain), but there was limited information on whether there are other adverse long-term health implications of developing shingles. There is a growing body of evidence that links VZV, the virus that causes shingles, to vascular disease. VZV vasculopathy may cause damage to blood vessels and increase the risk of stroke or coronary heart disease. Although some previous studies showed a higher risk of stroke or heart attack around the time of the shingles infection, it was not known whether this higher risk persisted in the long term. Therefore, the question we aimed to address in this study was to investigate whether shingles is associated with higher long-term risk of stroke or coronary heart disease. To address this question, we conducted a prospective longitudinal study in 3 large US cohorts of >200,000 women and men, the Nurses’ Health Study (>79,000 women), the Nurses’ Health Study II (almost 94,000 women) and the Health Professionals Follow-Up Study (>31,000 men), without a prior history of stroke or coronary heart disease. We collected information on shingles, stroke and coronary heart disease on biennial questionnaires and confirmed the diagnoses with medical record review. We followed the participants for up to 16 years and evaluated whether those who had developed shingles were at higher risk for stroke or coronary heart disease years after the shingles episode. The outcomes we measured were incident stroke, incident coronary heart disease . We also evaluated a combined outcome of cardiovascular disease, which included either stroke or coronary heart disease, whichever came first. MedicalResearch.com: What are the main findings?

Herpes Zoster Chest DermNet NZ image Response:  Our study showed that shingles is associated with about 30% higher long-term risk of a major cardiovascular event, and the elevated risk may persist for 12 years or more after having shingles. Specifically, compared with individuals with no history of shingles, the elevated risk was up to 38% higher risk for stroke: in pooled multivariable analyses accounting for multiple potential confounding factors, the multivariable-adjusted hazard ratios (MVHRs, 95% CIs) for incident stroke were 1.05 (0.88–1.25) among those with 1 to 4 years since HZ, 1.38 (1.10–1.74) among those with 5 to 8 years since shingles (HZ), 1.28 (1.03–1.59) among those with 9 to 12years since HZ, and 1.19 (0.90–1.56) among those with ≥13years since HZ. For coronary heart disease (CHD), the elevated risk was up to 25% higher: in pooled multivariable analyses, compared with individuals with no history of HZ, the MVHRs (95% CIs) for incident CHD were 1.13 (1.01–1.27) among those with 1 to 4 years since HZ, 1.16 (1.02–1.32) among those with 5 to 8 years since HZ, 1.25 (1.07–1.46) among those with 9 to 12 years since HZ, and 1.00 (0.83–1.21) among those with ≥13years since HZ. In addition, there was a suggestion that the magnitude of the elevated risk may be greater among those with potentially immunocompromising conditions.  MedicalResearch.com: What should readers take away from your report? Response: Our findings showed that a history of shingles is associated with higher long-term risk of a major cardiovascular event. Our findings suggest there are long-term implications of shingles and highlight the importance of public health efforts for prevention. Given the growing number of Americans at risk for this painful and often disabling disease and the availability of an effective vaccine, shingles vaccination could provide a valuable opportunity to reduce the burden on shingles and reduce the risk of subsequent cardiovascular complications. MedicalResearch.com: What recommendations do you have for future research as a results of this study?

Herpes Zoster - Shingles of Face: DermNet NZ image Response: Due to the timing of our study, much of the study period took place before the shingles vaccine became widely available; even once it was introduced, the uptake was generally low. The more recent non-live, recombinant subunit adjuvanted vaccine was not available until after the end of follow-up in our study. Therefore, we were not able to evaluate whether vaccination status may influence the association of shingles and long-term risk of a major cardiovascular event. As uptake of the newer shingles vaccine increases, future studies that evaluate whether vaccination status influences the relation of shingles and risk of cardiovascular disease would be informative. We are currently collecting this information among our participants and hope to conduct these studies in the future. Disclosures: Disclosures: Dr S. G. Curhan received an investigator‐initiated grant from GlaxoSmithKline Biologicals SA to examine the long‐term outcomes potentially associated with herpes zoster. Dr Yawn reports consulting with GlaxoSmithKline related to herpes zoster epidemiology and receipt of an investigator‐initiated grant related to herpes zoster and chronic obstructive pulmonary disease. Dr Kawai was employed by Boston Children's Hospital during the study and is now an employee of and a shareholder in Moderna, Inc. Dr G. C. Curhan is an employee of OM1, and receives royalties from UpToDate for being an author and Section Editor. The remaining authors have no disclosures to report. Citation: Herpes Zoster and Long‐Term Risk of Cardiovascular Disease Sharon G. Curhan MD, ScM scurhan@bwh.harvard.edu , Kosuke Kawai ScD , Barbara Yawn MD, MSc , Kathryn M. Rexrode MD, MPH , Eric B. Rimm ScD , and Gary C. Curhan MD, ScD 16 Nov 2022 https://doi.org/10.1161/JAHA.122.027451Journal of the American Heart Association. 2022;0:e027451 The information on MedicalResearch.com is provided for educational purposes only, and is in no way intended to diagnose, cure, or treat any medical or other condition. Always seek the advice of your physician or other qualified health and ask your doctor any questions you may have regarding a medical condition. In addition to all other limitations and disclaimers in this agreement, service provider and its third party providers disclaim any liability or loss in connection with the content provided on this website.     Read the full article

[packedwithpackards]

Examining the sources of the Plymouth Colony Pages [Part 37]

David Penrose and Peter Hill, "The Houses of Stonham Aspal," in The Suffolk Review, 4: no. 1.

This is not online but will be requested at some point.

James Savage, A Genealogical Dictionary of the First Settlers of New England, Showing Three Generations of Those Who Came Before May, 1692, on the Basis of Farmer's Register, 4 vols. (Boston: Little, Brown and Co., 1860-62; reprinted Baltimore, many editions).

This book only has one result for the Packards, which is on page 79.

F. Apthorp Foster, Vital Records of Scituate Massachusetts to the Year 1850, 2 Vols. (Boston: New England Historic Genealogical Society, 1909).

This book has three results for the name Packard. It isn't even worth listing them here.

Waldo Chamberlain Sprague, Genealogies of the Families of Braintree, Mass. 1640-1850. Sprague's extensive research on Braintree families was recorded by him on over 6,000 index cards, now at at the New England Historic Genealogical Society in Boston, and was published by NEHGS on CD-ROM in 2001.

This is found online here and there, but would need to go to the New England Historic Genealogical Society to see it.

Suffolk County Probate Records, Suffolk County Courthouse, 24 New Chardon Street, 3rd Floor, Boston, MA 02114.

Probably still have to still get these probate records in England.

Ipswich District Probate Registry, Haven House, 17, Lower Brook Street, Ipswich, Suffolk, England, IP4 1DN.

Probably still have to still get these probate records in England.

The American Genealogist (1932 to present).

You can read this either here or here.

Henry Edwards Scott, Vital Records of Taunton, Massachusetts, to the Year 1850, 3 Vols. (Boston: New England Historic Genealogical Society, 1928-1929).

It is online but barely so it cannot be searched online.

James Davenport, The Washbourne Family of Little Washbourne and Wichenford In the County of Worcester (London: Methuen & Co., 1907).

There are no results in this book which is online partially.

F. Apthorp Foster, Vital Records of West Bridgewater Massachusetts to the Year 1850 (Boston: New England Historic Genealogical Society, 1911).

This book is available on Internet Archive and there are 75 results in this book. On pages 82 to 86 are births in West Bridgewater.

Vital Records of Wenham Massachusetts to the End of the Year 1849 (Salem, MA: The Essex Institute, 1904).

No results for "Packard" were available on the version scanned on Internet Archive.

George Walter Chamberlain, et. al., History of Weymouth Massachusetts, 4 Vols. (Boston: Weymouth Historical Society, 1923).

This book seems to be on Ancestry.com. There are 27 results for the name Packard.

Note: This was originally posted on Apr. 27, 2018 on the main Packed with Packards WordPress blog (it can also be found on the Wayback Machine here). My research is still ongoing, so some conclusions in this piece may change in the future.

© 2018-2022 Burkely Hermann. All rights reserved.

[hmstckpanels]

> Tavros: Take lance.

[giuseppenoc]

SARS-CoV-2: Varias variantes escapan a la neutralización por la inmunidad humoral inducida por la vacuna

Un Nuevo artículo ha sido publicado en https://web2meet.net/sars-cov-2-varias-variantes-escapan-a-la-neutralizacion-por-la-inmunidad-humoral-inducida-por-la-vacuna/

SARS-CoV-2: Varias variantes escapan a la neutralización por la inmunidad humoral inducida por la vacuna

EN RESUMEN. Los análisis de suero de individuos vacunados con una o dos dosis de vacunas de ARNm contra 10 variantes circulantes de SARS-CoV-2, muestran que P.1 y B.1.351 en particular exhiben una neutralización limitada por inmunidad humoral inducida por la vacuna. Se encontró que este escape estaba mediado en gran parte por mutaciones en el dominio de unión al receptor del pico de SARS-CoV-2.

A partir de aquí: Traducción literal al idioma español del artículo OFICIAL DOI (IDENTIFICADOR DE OBJETOS DIGITALES.

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013

Wilfredo F. Garcia-Beltran, Evan C. Lam, Kerri St. Denis, Adam D. Nitido, ZeidyH. Garcia, Blake M. Hauser, Jared Feldman, Maia N. Pavlovic, David J. Gregory,Mark C. Poznansky, Alex Sigal, Aaron G. Schmidt, A. John Iafrate, Vivek Naranbhai,Alejandro B. Balazs

Para aparecer en: Célula Fecha de recepción: 12 de febrero de 2020 Fecha de revisión: 26 de febrero de 2021 Fecha de aceptación: 8 de marzo de 2021

Cite este artículo como: García-Beltrán, WF, Lam, EC, St. Denis, K., Nitido, AD, García, ZH, Hauser, BM, Feldman, J., Pavlovic, MN, Gregory, DJ, Poznansky, MC, Sigal, A., Schmidt, AG, Iafrate, AJ, Naranbhai, V., Balazs, AB, Varias variantes del SARS-CoV-2 escapan a la neutralización por inmunidad humoral inducida por la vacuna, Cell (2021), DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013

Este es un archivo PDF de un artículo que ha sufrido mejoras después de su aceptación, como la adición de una portada y metadatos, y el formato para facilitar la lectura, pero aún no es la versión definitiva del registro. Esta versión se someterá a corrección de estilo adicional, composición tipográfica y revisión antes de que se publique en su forma final, pero proporcionamos esta versión para dar visibilidad temprana del artículo. Tenga en cuenta que, durante el proceso de producción, se pueden descubrir errores que podrían afectar el contenido, y todas las renuncias legales que se aplican a la revista pertenecen. © 2021 El (los) autor (es). Publicado por Elsevier Inc.

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Múltiples variantes del SARS-CoV-2 escapan a la neutralización por inmunidad humoral inducida por la vacuna

1 Estos autores contribuyeron igualmente 2 Departamento de Patología, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, 02114, EE. UU. 3 Departamento de Patología, Hospital Brigham and Women’s, Boston, MA, 02115, EE. UU. 4 Instituto Ragon de MGH, MIT y Harvard, Cambridge, MA, 02139, EE. UU. 5 Centro de vacunas e inmunoterapia, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, 02129, EE. UU. 6 Enfermedades infecciosas pediátricas, Hospital General para Niños de Massachusetts, Boston, MA 02114, EE. UU. 7 Departamento de Medicina, Hospital General de Massachusetts, Boston , MA, 02114, EE. UU. 8 Instituto de Investigación en Salud de África, Durban, 4001, Sudáfrica 9 Escuela de Trabajo atory Medicine and Medical Sciences, University of KwaZulu-Natal, Durban, 4041 South Africa 10Max Planck Institute for Infection Biology, Berlin, 10117, Germany 11 Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, 02215, USA 12Center for the AIDS Program of Research in Sudáfrica, Durban, 4001, Sudáfrica

Contacto principal; correspondencia: abalazs@mgh.harvard.edu

RESUMEN

La vacunación provoca respuestas inmunitarias capaces de neutralizar de forma potente el SARS-CoV-2. Sin embargo, la vigilancia en curso ha revelado la aparición de variantes que albergan mutaciones en spike, el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes. Para comprender el impacto de estas variantes, evaluamos la potencia de neutralización de 99 individuos que recibieron una o dos dosis de las vacunas BNT162b2 o ARNm-1273 contra pseudovirus que representan 10 cepas circulantes de SARS-CoV-2 en todo el mundo. Cinco de los 10 pseudovirus que albergaban mutaciones en el dominio de unión al receptor, incluidos K417N / T, E484K y N501Y, eran muy resistentes a la neutralización. La neutralización cruzada de las variantes de B.1.351 fue comparable al SARS-CoV y al WIV1-CoV derivado de murciélago, lo que sugiere que un número relativamente pequeño de mutaciones puede mediar un escape potente de las respuestas a la vacuna. Si bien el impacto clínico de la resistencia a la neutralización sigue siendo incierto, estos resultados destacan la posibilidad de que las variantes escapen de la inmunidad humoral neutralizadora y enfatizan la necesidad de desarrollar intervenciones protectoras amplias contra la pandemia en evolución. PALABRAS CLAVE: COVID-19; SARS-CoV-2; pico; variantes; RBD; anticuerpos neutralizantes; escapar

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INTRODUCCIÓN

Desde la primera infección humana descrita con el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en diciembre de 2019, se han aprobado nueve vacunas para su uso en humanos (“COVID-19 Vaccine Tracker” n.d.). Dos de las vacunas que se utilizan actualmente en todo el mundo, BNT162b2 (fabricada por Pfizer) y mRNA-1273 (fabricada por Moderna), se basan en la liberación de nanopartículas lipídicas de mRNA que codifica una forma estabilizada de prefusión de proteína de pico derivada del SARS-CoV-2 aislado temprano en la epidemia de Wuhan, China. Ambas vacunas demostraron una eficacia> 94% en la prevención de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) en estudios clínicos de fase III realizados a finales de 2020 en varios países (Polack et al. 2020; Baden et al. 2021). Sin embargo, la reciente aparición de nuevas variantes circulantes ha suscitado importantes preocupaciones sobre la eficacia geográfica y temporal de estas intervenciones. De hecho, los ensayos completados más recientemente de dos vacunas basadas en adenovirus (AZD1222 de Astrazeneca y JNJ-78436735 de Johnson & Johnson), una vacuna basada en nanopartículas (NVX-CoV2373 de Novavax) y una vacuna de proteína inactivada (Coronavac) han demostrado una reducción eficacia general («La vacuna Novavax COVID-19 demuestra una eficacia del 89,3% en el ensayo de fase 3 del Reino Unido» nd, «La vacuna AZD1222 alcanzó el criterio de valoración principal de eficacia en la prevención de COVID-19» 2020), y los análisis de subconjuntos sugieren una marcada variación geográfica con menor eficacia contra leves enfermedad a moderada en países como Sudáfrica y Brasil, donde la epidemia está dominada por cepas variantes. En conjunto, estos datos sugieren que las variantes resistentes a la neutralización pueden haber contribuido a estos resultados («Sudáfrica suspende el uso de la vacuna COVID-19 de AstraZeneca después de que no logra detener claramente la variante del virus» 2021; Herper et al. 2021). Una de las primeras variantes que surgió y rápidamente se convirtió en dominante a nivel mundial fue D614G. Si bien varios estudios demostraron que esta cepa es más infecciosa (Korber et al. 2020; Yurkovetskiy et al. 2020a, [b] 2020; Plante et al. 2020; Zhou et al. 2020; Hou et al. 2020), nosotros y otros encontraron que los sueros de individuos convalecientes mostraron una neutralización cruzada efectiva de las variantes de tipo salvaje y D614G (García-Beltran et al. 2021; Legros et al. 2021; Hou et al. 2020). Sin embargo, la vigilancia genómica reciente en el Reino Unido ha revelado una rápida expansión de un nuevo linaje denominado B.1.1.7 (también conocido como VOC-202012/01 o 501Y.V1). B.1.1.7 alberga 3 deleciones de aminoácidos y 7 mutaciones sin sentido en spike, que incluyen D614G y N501Y en el dominio de unión al receptor ACE2 (RBD), y se ha informado que es más infeccioso que D614G (Santos y Passos 2021; Galloway et al.2021; Liu et al.2021). Varios estudios han demostrado que los sueros de convalecientes y vacunados neutralizan de forma cruzada las variantes de B.1.1.7 con una potencia solo ligeramente disminuida, lo que sugiere que la infección previa o la vacunación con el SARS-CoV-2 de tipo salvaje aún pueden brindar protección contra las variantes de B.1.1.7

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(Wu et al. 2021; Muik et al. 2021; Shen et al. 2021; Rees-Spear et al. 2021; P. Wang et al. 2021). También ha habido informes de transmisión del SARS-CoV-2 entre humanos y visones en Dinamarca con una variante llamada grupo 5 de visón o B.1.1.298, que alberga una deleción de 2 aminoácidos y 4 mutaciones sin sentido, incluida Y453F en RBD. Las preocupaciones relacionadas con la transmisión entre especies en curso dieron como resultado el sacrificio de más de 17 millones de visones daneses para evitar una mayor propagación y evolución viral (Oude Munnink et al.2021; Oxner 2020). Otra variante que surgió recientemente en California, Estados Unidos, designada como B.1.429, contiene 4 mutaciones sin sentido en pico, una de las cuales es una única mutación L452R RBD. Aún no se ha determinado la capacidad de las variantes B.1.1.298 y B.1.429 para evadir la inmunidad humoral neutralizante de una infección o vacunación previa. De particular preocupación es una mutación E484K en RBD, que se identificó previamente a través de experimentos de selección in vitro para escapar de los anticuerpos monoclonales (Baum et al.2020) y también se identificó recientemente mediante un escaneo mutacional profundo como una variante con el potencial de evadir monoclonales y respuestas de anticuerpos en suero (Greaney et al. 2020, 2021). Las variantes novedosas que surgen del linaje B.1.1.28 descritas por primera vez en Brasil y Japón, denominadas P.2 (con mutaciones de sentido erróneo de 3 picos) y P.1 (con mutaciones de sentido erróneo de 12 picos), contienen esta mutación E484K y P.1 en particular también contiene mutaciones K417T y N501Y en RBD. Estas cepas se han propagado rápidamente, y tanto P.2 como P.1 se encontraron recientemente en casos documentados de reinfección por SARS-CoV-2 (Paiva et al. 2020; Faria et al. 2021; Resende et al. 2021; Naveca et al.2021; Nonaka et al.2021). La mayor preocupación ha sido la aparición de múltiples cepas del linaje B.1.351 (también conocido como 501Y.V2), que se informaron por primera vez en Sudáfrica y desde entonces se han extendido por todo el mundo (Tegally et al. 2021). Este linaje tiene tres mutaciones RBD, K417N, E484K y N501Y, además de varias mutaciones fuera de RBD, y varios informes han sugerido que los sueros de convalecientes y vacunados tienen una neutralización cruzada disminuida de variantes del linaje B.1.351 (P. Wang et al. 2021; Wibmer et al.2021; Wu et al.2021; Hu et al.2021). Una limitación clave de varios de estos informes ha sido el uso de mutaciones únicas o combinaciones de mutaciones que no ocurren naturalmente. Independientemente, la aparición de variantes novedosas que parecen escapar de las respuestas inmunes ha impulsado a los fabricantes de vacunas a desarrollar refuerzos para estas variantes de picos (“Moderna Developing Booster Shot for New Virus Variant B.1.351” n.d.). Aquí, evaluamos sistemáticamente el potencial de neutralización de los sueros de una cohorte de individuos que recibieron una o dos dosis de la vacuna BNT162b2 (Pfizer) o mRNA-1273 (Moderna) contra los pseudovirus del SARS-CoV-2 que portan proteínas de punta que se encuentran en las cepas circulantes. . Utilizamos nuestro ensayo de neutralización de pseudovirus de alto rendimiento descrito anteriormente (García-Beltran et al.2021) para cuantificar la neutralización contra variantes que surgen por primera vez en el Reino Unido (B.1.1.7), Dinamarca (B.1.1.298 ), Estados Unidos (B.1.429), Brasil y Japón (P.2 y P.1) y Sudáfrica (tres variantes del linaje B.1.351), así como el SARS-CoV del brote de 2002 en Hong Kong y el coronavirus de murciélago preemergente WIV1-CoV. Encontramos que, aunque la neutralización se conserva en gran medida contra muchas variantes, las que contienen las mutaciones K417N / T, E484K y N501Y RBD, es decir, las variantes P.1 y B.1.351, han disminuido significativamente la neutralización incluso en individuos completamente vacunados. Los individuos que recibieron solo una única dosis reciente de vacuna tuvieron títulos de neutralización más débiles en general y no mostraron neutralización detectable de variantes de B.1.351 en nuestros ensayos. Tomados en conjunto, nuestros resultados destacan que las vacunas BNT162b2 y mRNA-1273 logran solo una neutralización cruzada parcial de nuevas variantes y respaldan la reformulación de vacunas existentes para incluir diversas secuencias de picos. En última instancia, puede ser necesario el desarrollo de nuevas vacunas capaces de provocar anticuerpos ampliamente neutralizantes para resolver la pandemia en curso.

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RESULTADOS

Aparición y propagación mundial de variantes preocupantes del SARS-CoV-2

Desde el primer caso descrito de infección por SARS-CoV-2 en Wuhan, China, en diciembre de 2019, se han documentado más de 107 millones de infecciones confirmadas (Coronavirus.jhu.edu), lo que permite la diversificación viral y el surgimiento de seis linajes principales distintos con numerosos variantes. Un subconjunto de estas variantes ha sido denotado como variantes de preocupación por la Organización Mundial de la Salud dada la presencia de mutaciones con potencial para aumentar la transmisibilidad, virulencia o evadir las respuestas inmunes. Nos centramos en las variantes preocupantes descritas por primera vez en el Reino Unido (B.1.1.7), Dinamarca (B.1.1.298), Estados Unidos (B.1.429), Brasil y Japón (P.2 y P.1), y Sudáfrica (B.1.351), la mayoría de los cuales surgieron a fines de 2020 (Figura 1A-B). Aunque las mutaciones que surgen naturalmente en estas variantes abarcan toda la proteína de pico, ocurren principalmente en S1 y RBD, el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes (Figura 1C y S1). Después de analizar las secuencias de pico de SARS-CoV-2 depositadas para cada linaje en GISAID, identificamos mutaciones de secuencia de consenso que representan la cepa circulante dominante para cada linaje (Figura 1D y S1). En el caso del linaje B.1.351, estudiamos tres de las variantes dominantes que comprenden la mayoría de las secuencias depositadas, que designamos v1, v2 y v3. Las tres mutaciones principales de RBD de interés son: (i) N501Y, presente en las variantes B.1.1.7, P.1 y B.1.351; (ii) E484K, presente en las variantes P.2, P.1 y B.1.351; y (iii) K417T para la variante P.1 y K417N para las variantes B.1.351. Por separado, la variante B.1.1.298 encontrada en visones daneses contenía una mutación Y453F en RBD, y la variante B.1.429 de California contenía un L452R. Aunque son parientes lejanos, el SARS-CoV del brote de coronavirus de Hong Kong de 2002 y el WIV1-CoV preemergente derivado de murciélagos comparten una homología de pico de ~ 76% con el SARS-CoV-2 y se evaluaron para proporcionar una comparación con coronavirus serológicamente distintos (Figura 1A y 1D).

Respuestas de neutralización provocadas por la vacuna a las cepas circulantes de SARS-CoV-2

Acumulamos una cohorte de 99 individuos que recibieron una o dos dosis completas de las vacunas BNT162b2 o mRNA-1273, y usamos un ensayo de neutralización de pseudovirus lentivíricos basado en luminiscencia que nosotros y otros han validado previamente (C. Wang et al. 2020; Ju et al. 2020; Pinto et al. 2020; Yang et al. 2020; Moore et al. 2004; Crawford et al. 2020; García-Beltran et al. 2021 ) para evaluar la neutralización de las variantes del SARS-CoV-2 en un sistema de alto rendimiento (Figura 2A-B). Esta cohorte era relativamente joven (mediana de edad: 33 años, rango: 22 – 73 años) y el 62,6% (62/99) mujeres y el 37,4% (37/99) hombres (Figura S2). Comparamos sueros de 1220 muestras prepandémicas que habíamos analizado previamente utilizando el mismo ensayo (García-Beltrán et al. 2021) con nuestra cohorte de vacunados. El análisis de las características operativas del receptor mostró

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que el ensayo de neutralización de pseudovirus fue capaz de discriminar con precisión entre individuos no vacunados y vacunados ≥7 días después de la segunda dosis de BNT162b2 o mRNA-1273 (AUC = 0,9998), con una sensibilidad del 100% y una especificidad de 99% utilizando el límite de detección del ensayo (pNT50 de 12) como punto de corte (Figura S3). Entre los no vacunados y los individuos que recibieron 1 dosis de vacuna (o <7 días después de la segunda dosis), la sensibilidad se redujo al 93% (Figura S3). Los sueros obtenidos de individuos que recibieron 2 dosis completas de vacuna mostraron una fuerte neutralización del pseudovirus del SARS-CoV-2 de tipo salvaje, con los receptores de BNT162b2 logrando un título medio de 2.016 y los receptores de ARNm-1273 con un título medio de 762 (esta diferencia no fue estadísticamente significativo) (Figura 3A). Los individuos que recibieron solo una dosis de vacuna (o <7 días después de la segunda dosis) tuvieron una neutralización significativamente más baja, pero fácilmente detectable, con títulos medios de 167 para BNT162b2 y 208 para mRNA-1273 (Figura 3C). Al comparar el título de neutralización de pseudovirus en función del tiempo posterior a la vacunación, observamos un aumento esperado en el título después de la segunda dosis (Figura 3B). La magnitud de la neutralización se correlacionó con los niveles totales de anticuerpos anti-RBD; sin embargo, esta correlación fue pobre dado que la mayoría de los vacunados alcanzaron el límite superior de detección de nuestro ELISA (Figura 3C). Ni el sexo ni la edad parecieron influir significativamente en los títulos de neutralización en nuestra cohorte (Figura 3D-E). La neutralización del pseudovirus D614G fue similar a la del tipo salvaje en individuos que recibieron dos dosis de vacuna (disminución de 1.2 veces para ambas vacunas de 2 dosis) (Figura 4A-D y S4A), lo que contrasta con estudios previos en sueros convalecientes. que nosotros y otros llevamos a cabo demostrando una neutralización ligeramente aumentada de la variante D614G frente al tipo salvaje (García-Beltrán et al. 2021) después de una infección natural. El efecto fue más pronunciado en los individuos que recibieron una dosis de vacuna, algunos de los cuales tenían una neutralización indetectable de D614G a pesar de la neutralización detectable del SARS-CoV-2 de tipo salvaje (Figura 4A-B). Esta diferencia puede ser una consecuencia de la vacuna que codifica la secuencia de picos de tipo salvaje, mientras que muchos individuos convalecientes en estudios anteriores probablemente estaban infectados con la variante D614G del SARS-CoV-2, dado que ya se había convertido en la cepa dominante a nivel mundial en el verano de 2020. (Lemieux et al. 2020; Korber et al. 2020). Al evaluar variantes que contienen una mutación RBD como parte de su paisaje mutacional, la variante B.1.1.7 (N501Y) del Reino Unido, la variante B.1.1.298 (Y453F) del visón danés y la variante B.1.429 (L452R) de California exhibieron una neutralización que fue generalmente similar a la de tipo salvaje y la variante D614G parental. Entre las personas que recibieron 2 dosis completas de

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BNT162b2, la disminución media de veces en la neutralización con respecto al tipo salvaje fue 2,1 veces para B.1.1.7, 1,4 veces para B.1.1.298 y 2,0 veces para B.1.429 (Figura 4C y S4A); para aquellos que recibieron 2 dosis completas de ARNm-1273, la disminución media de la neutralización en relación con el tipo salvaje fue de 2,3 veces para B.1.1.7, 1,3 veces para B.1.1.298 y 2,0 veces para B. 1.429 (Figura 4D y S4A). Sin embargo, la neutralización de la variante brasileña / japonesa P.2, cuyo RBD contiene una mutación E484K, se redujo significativamente (5,8 veces para BNT162b2, p <0,001; 2,9 veces para mRNA-1273, p <0,01) (Figura 4C- D y S4A). Esto está en línea con estudios previos que sugieren que la mutación E484K puede evadir respuestas de anticuerpos policlonales (Greaney et al. 2020; Jangra et al. 2021) y se ha encontrado en casos de reinfección por SARS-CoV-2 (Paiva et al. 2020). ; Faria et al.2021; Resende et al.2021; Naveca et al.2021; Nonaka et al.2021). De manera similar, las respuestas de anticuerpos neutralizantes también disminuyeron significativamente para la cepa P.1 brasileña / japonesa (6,7 veces para BNT162b2, p <0,0001; 4,5 veces para mRNA-1273, p <0,001), que alberga tres mutaciones en RBD (K417T , E484K y N501Y) y también se ha encontrado en casos de reinfección (nuno_faria 2021). Sorprendentemente, la neutralización de las tres cepas sudafricanas B.1.351 se redujo sustancialmente para ambas vacunas de 2 dosis (v1: 34,5 veces para BNT162b2 y 27,7 veces para mRNA-1273; v2: 41,2 veces para BNT162b2 y 20,8 veces para ARNm-1273; v3: 42,4 veces para BNT162b2 y 19,2 veces para ARNm-1273; p <0,0001 para todas las comparaciones) (Figura 4C-D y S4A). Estas cepas contienen las mismas tres mutaciones RBD que P.1 excepto por una sustitución de asparagina frente a treonina en K417 (K417N) y varias mutaciones adicionales en regiones no RBD. Sorprendentemente, encontramos que la disminución en la neutralización de las cepas B.1.351 fue similar a la de los coronavirus relacionados lejanamente, a saber, SARS-CoV (43,8 veces para BNT162b2 y 33,5 veces para mRNA-1273) y WIV1-CoV (44,3- veces para BNT162b2 y 26,5 veces para ARNm-1273), lo que sugiere que un número relativamente pequeño de mutaciones puede medicar un escape potente de las respuestas de anticuerpos neutralizantes inducidas por la vacuna. Estas diferencias sustanciales en la neutralización no pudieron explicarse por diferencias en la expresión de la proteína de pico (Figura S4B) ni en la cantidad de pseudovirus usado en el ensayo (Figura S4C). En particular, el 36,7% (11/30) de los receptores de 2 dosis de BNT162b2 y el 42,9% (15/35) de los receptores de 2 dosis de las vacunas de mRNA-1273 no tuvieron neutralización detectable de al menos una de las variantes B.1.351 (Figura 4A -B). De los individuos que recibieron solo 1 dosis de BNT162b2 o mRNA-1273, todos tuvieron una neutralización indetectable de B.1.351 v2 y v3, excepto cuatro individuos que informaron haber tenido una infección previa por COVID-19 o una exposición significativa y un individuo para el cual no se obtuvo un historial de COVID-19. Esto sugiere que una sola dosis de vacunas de ARNm existentes puede ser insuficiente para inducir respuestas de anticuerpos neutralizantes cruzados en individuos no infectados previamente.

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Curiosamente, los seis individuos de nuestro estudio que informaron haber tenido una infección previa por COVID-19 o una exposición significativa tenían los títulos de neutralización más altos para la mayoría de las variantes y exhibieron una neutralización cruzada sustancial de B.1.351, SARS-CoV y WIV1-CoV (Figura 4A-B y S2). Esto sugiere que la infección previa combinada con la vacunación puede resultar en la mayor amplitud de respuestas de anticuerpos neutralizantes con reactividad cruzada, incluso contra coronavirus relacionados lejanamente.

La resistencia a la neutralización de las variantes de B.1.351 se debe principalmente a mutaciones de RBD.

Para caracterizar mejor el contexto mutacional responsable de la resistencia a la neutralización de B.1.351, exploramos la contribución de las mutaciones ubicadas tanto dentro como fuera de la región de pico de RBD. Es de destacar que muchas de las sustituciones y deleciones encontradas en el linaje B.1.351 están en estrecha proximidad estructural en el dominio S1 (Figura 5A). Sin embargo, el 86,2% de las secuencias de GISAID disponibles de este linaje albergan estas mutaciones en tres patrones distintos representados por B.1.351 v1 (46,6%), v2 (31,6%) y v3 (8,0%). Creamos pseudovirus en los que las regiones RBD de B.1.351 v1, v2 y v3 se revertieron a su secuencia original de Wuhan de tipo salvaje (v1 / wtRBD, v2 / wtRBD y v3 / wtRBD) mientras conservaban todos los demás B.1.351 v1 , v2 o v3 mutaciones. Sorprendentemente, los ensayos de neutralización realizados con sueros de 24 individuos que recibieron la vacuna BNT162b2 de 2 dosis revelaron que la neutralización de B.1.351 v1, v2 y v3 en ausencia de mutaciones RBD era comparable a la de D614G (Figura 5B-C). Un pseudovirus que lleva solo las tres mutaciones RBD (K417N, E484K y N501Y), en gran parte, pero no del todo, recapituló el fenotipo de escape (Figura 5B y 5D). A pesar de este escape, los anticuerpos mostraron unión reducida, pero detectable, a la proteína RBD mutante que alberga mutaciones B.1.351 (K417N, E484K y N501Y) por ELISA, que se correlacionó con la neutralización de pseudovirus K417N + E484K + N501Y (R2 = 0,67, p <0,0001 ) (Figura 5E). Esto sugiere que los anticuerpos provocados por la vacuna capaces de unirse al RBD mutante pueden conservar la capacidad de neutralizar los pseudovirus mutantes del RBD. Al evaluar la contribución de las mutaciones RBD frente a las no RBD hacia el escape, los análisis de regresión proporcionaron evidencia estadística de la interacción entre mutaciones dentro y fuera de RBD en la mediación del escape de variantes de B.1.351, consistente con los efectos sinérgicos (es decir, no aditivos) de estas mutaciones. (las estadísticas de interacción para B.1.351 v1 fue p = 0.06, v2 fue p <0.0001 y v3 fue p <0.0001). Estos resultados sugieren que, si bien las mutaciones RBD contribuyen con la mayor parte del escape observado de la neutralización inducida por la vacuna, son más efectivas cuando se encuentran en el contexto de mutaciones adicionales, particularmente las que se encuentran en las variantes B.1.351 v2 y v3.

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DISCUSIÓN

Tradicionalmente, se cree que las respuestas inmunes policlonales que surgen en el contexto de la infección y la vacunación se dirigen a múltiples epítopos antigénicos. Dada esta suposición, la expectativa sería que un pequeño número de variaciones en la secuencia de antígeno tuvieran solo efectos modestos sobre el reconocimiento por parte del sistema inmunológico. Aquí, encontramos que mientras muchas cepas, como B.1.1.7, B.1.1.298 o B.1.429, continúan siendo potentemente neutralizadas a pesar de la presencia de mutaciones individuales de RBD, otras variantes circulantes de SARS-CoV-2 escapan inmunidad humoral inducida por la vacuna. El P.2. La variante, que contiene una mutación E484K dentro de la región RBD, fue capaz de reducir significativamente la potencia de neutralización de individuos completamente vacunados, de acuerdo con lo sugerido por el escaneo mutacional profundo (Greaney et al. 2020; Jangra et al. 2021). De manera similar, la cepa P.1, que tiene tres mutaciones RBD, escapó de manera más efectiva a la neutralización, posiblemente explicando los casos recientemente reportados de reinfección con esta variante (Paiva et al.2020; Faria et al.2021; Resende et al.2021; Naveca et al.2021; Nonaka et al.2021). Finalmente, encontramos que las variantes de B.1.351 exhibieron una notable resistencia a la neutralización, en gran parte debido a tres mutaciones en RBD pero con una contribución medible de mutaciones no RBD. La magnitud del efecto es tal que las cepas B.1.351 escaparon a las respuestas de neutralización de la vacuna tan eficazmente como los coronavirus relacionados lejanamente. Dada la pérdida de la potencia de la vacuna contra varias variantes circulantes, la mayoría de los individuos que recibieron una sola dosis de vacuna no obtuvieron títulos de anticuerpos suficientes para proporcionar una neutralización cruzada detectable contra B.1.351 v2 o v3. Si bien nuestros estudios están limitados por el tiempo de seguimiento relativamente corto después de la vacunación, nuestros hallazgos respaldan la importancia de los regímenes de 2 dosis para lograr títulos, y quizás amplitud, para mejorar la protección contra variantes nuevas. Es importante considerar estos hallazgos en el contexto de las propuestas para administrar una dosis única de vacuna a un mayor número de personas en lugar de utilizar dosis para estimular a los receptores anteriores.Es importante destacar que nuestros estudios se basan en pseudovirus que solo son capaces de modelar la entrada dependiente de ACE2. paso del ciclo de vida del SARS-CoV-2. Si bien numerosos estudios ahora han demostrado una estrecha correlación entre los títulos de neutralización medidos contra pseudovirus y cultivos vivos de SARS-CoV-2 (C. Wang et al. 2020; Ju et al. 2020; Pinto et al. 2020; Yang et al. 2020; Moore et al.2004; Crawford et al.2020; Riepler et al.2020), no está claro qué impacto pueden tener mutaciones adicionales ubicadas fuera del pico en el escape inmunológico, la virulencia, la infectividad o la patogénesis. Varios informes y preimpresos recientes, incluidos los estudios realizados por Pfizer y Moderna, han producido hallazgos similares en términos de potencia de la vacuna contra las variantes B.1.1.7 y B.1.1.298, pero sustancialmente menos resistencia a la neutralización por

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B.1.351 de lo que medimos. Sin embargo, debemos advertir que cada estudio se realizó con distintas muestras de suero medidas utilizando diferentes condiciones (p. Ej., Virus de la estomatitis vesicular quimérica con capacidad de replicación versus pseudovirus lentiviral de entrada única) y con diferentes plásmidos de expresión de picos y combinaciones de mutaciones (p. Ej., Mutaciones triples RBD, mutaciones que definen el linaje, complemento completo de mutaciones que aún no se han observado juntas en la naturaleza, etc.). En el presente estudio, imitamos el patrón natural de mutaciones que se encuentran en las cepas circulantes, en fase. Es importante destacar que estos incluyen las variantes de picos que se encuentran en dos cepas de virus vivos competentes para la replicación del linaje B.1.351, que recientemente se informó que exhiben una resistencia a la neutralización casi completa en respuesta al plasma convaleciente (Cele et al. 2021). Las cepas utilizadas en el estudio mencionado anteriormente se designaron como 501Y.V2.HVdF002 y 501Y.V2.HV001, que tienen secuencias de proteínas de pico idénticas a las de los pseudovirus B.1.351 v1 y B.1.351 v2 informados en este estudio. Nuestro trabajo no aborda la inmunidad celular aportada por los linfocitos citotóxicos, incluidas las células T y NK. Incluso en ausencia de la inmunidad humoral neutralizante, estudios previos han sugerido que la inmunidad celular puede mitigar una infección grave o prolongada (Le Bert et al. 2020). En los individuos convalecientes, la inmunidad de las células T no se limitaría a los epítopos derivados de espigas, sino también a otras proteínas más abundantes como la nucleocápside. Como tal, sería razonable suponer que la inmunidad mediada por células T provocada por la infección permanecería en gran parte intacta para las variantes circulantes que incluyen B.1.351. De hecho, aunque los estudios recientes de Johnson & Johnson han demostrado una eficacia general reducida en Sudáfrica, hubo una protección sustancialmente mayor contra la enfermedad grave o fatal que contra la enfermedad leve a moderada (Herper et al. 2021). Sin embargo, con la excepción de las vacunas de virus enteros muertos, todos los diseños de vacunas disponibles actualmente solo proporcionan proteína de pico como inmunógeno diana, lo que limita la inmunidad de las células T a los epítopos de pico. No obstante, un estudio reciente ha demostrado que las mutaciones en los epítopos de las espigas no alteran las respuestas de las células T a pesar de escapar de los anticuerpos neutralizantes (Skelly et al. 2021). En resumen, nuestros datos destacan los desafíos que enfrentan todas las vacunas cuyos diseños se finalizaron temprano en la pandemia y se basaron en la secuencia del primer virus reportado en Wuhan, China. Dada la escala mundial y la magnitud de la pandemia en curso, incluidos los informes de casos de reinfección, está claro que la evolución viral continuará. Es posible que las vacunas actuales aún proporcionen un beneficio clínico contra variantes que exhiben una neutralización cruzada deficiente, como P.1 y B.1.351, al reducir la gravedad de la enfermedad COVID-19, pero esto aún no se ha determinado. En última instancia, será importante desarrollar intervenciones capaces de prevenir la transmisión de diversas variantes del SARS-CoV-2, incluidos los refuerzos de vacunas que se dirigen a estas

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variantes o tecnologías capaces de provocar o administrar anticuerpos ampliamente neutralizantes.

LIMITACIONES DEL ESTUDIO

El objetivo principal de este estudio fue evaluar el potencial de los sueros de los vacunados para neutralizar las variantes circulantes del SARS-CoV-2. Para ello, desarrollamos un ensayo de neutralización in vitro basado en pseudovirus lentivirales de alto rendimiento que utiliza una línea celular 293T-ACE2 diseñada como células diana. Como tal, estas células restringen la entrada de pseudovirus de una manera dependiente de ACE2 y carecen de otras proteínas de la superficie celular que pueden desempeñar un papel en la infección natural, como TMPRSS2 (Hoffmann et al. 2020) o NRP1 (Cantuti-Castelvetri et al. 2020). ). Se necesitan estudios adicionales para evaluar la influencia de estas proteínas en los títulos de neutralización sérica medidos. No evaluamos otras funciones mediadas por anticuerpos, como la deposición del complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, que pueden contribuir a la protección incluso en ausencia de anticuerpos neutralizantes. Además, no evaluamos el papel de las respuestas inmunitarias celulares provocadas por la vacuna mediadas por células T y células NK, que probablemente desempeñen un papel clave en la prevención de enfermedades para los receptores de la vacuna.

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AGRADECIMIENTOS, APOYO FINANCIERO

Queremos agradecer a Michael Farzan, PhD, por proporcionar células 293T que expresan ACE2. También agradecemos a Mandakolathur Murali, MD por muchas discusiones útiles y reveladoras. B.M.H. y cuenta con el respaldo del premio Número T32GM007753 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales. J.F. es compatible con T32AI007245. D.J.G., M.C.P. y M.N.P. fueron apoyados por el fondo de innovación VIC. COMO. fue apoyado por Bill y Melinda Gates Investment INV-018944 (AS) y por el South African Medical Research Council y el Departamento de Ciencia e Innovación (TdO), A.G.S. fue apoyado por NIH R01 AI146779 y una subvención del Consorcio de Massachusetts sobre Preparación para la Patogenia (MassCPR). A.J.I. cuenta con el apoyo de la Lambertus Family Foundation. TEJIDO. recibió el apoyo del Premio Avenir Nuevo Innovador DP2DA040254 de los Institutos Nacionales para el Abuso de Drogas (NIDA), el Programa de Académicos Transformadores de MGH, así como fondos de la Fundación Charles H. Hood. Esta investigación independiente fue apoyada por el Programa de Becarios de Investigación en Ciencias de Gilead en VIH.

CONTRIBUCIONES DEL AUTOR

W.F.G.B., E.C.L., K.S.D. y A.B.B. diseñó los experimentos. W.F.G.B., E.C.L., K.S.D., Z.G., A.D.N., V.N. y A.B.B. llevó a cabo experimentos y analizó datos. J.F., B.M.H. y A.G.S. proporcionó reactivos clave y discusiones e ideas útiles. D.J.G., M.C.P. y M.N.P. proporcionó muestras humanas para el estudio. A.D.N. y V.N. contribuido a los análisis estadísticos y de secuencia. A.J.I. y V.N. proporcionó discusiones clave y aportes al diseño experimental. W.F.G.B., V.N. y A.B.B. escribió el artículo con contribuciones de todos los autores.

DECLARACIONES DE INTERÉS

Los autores declaran no tener intereses en competencia

P15 a P20

Por favor referirse al artículo original en inglés. En estas páginas están explicadas la lista de figuras anexas al artículo así como los suplementos. Como son datos técnicos son perfectamente entendibles aún en inglés. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013

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STAR ★ MÉTODOS

DISPONIBILIDAD DE RECURSOS.

Contacto principal. La información adicional y las solicitudes de recursos y reactivos deben ser dirigidas y serán atendidas por Alejandro Balazs (abalazs@mgh.harvard.edu).

Disponibilidad de materiales. Los plásmidos generados en este estudio estarán disponibles a través de Addgene. Las proteínas y anticuerpos recombinantes están disponibles en sus respectivas fuentes.

Disponibilidad de código y datos. Este estudio no generó código ni datos de secuencia. Los datos generados en el estudio actual (incluidos ELISA y neutralización) no se han depositado en un repositorio público, pero están disponibles del autor correspondiente a pedido.

MODELO EXPERIMENTAL Y DETALLES DEL SUJETO.

Sujetos humanos. El uso de muestras humanas fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de Partners (protocolo 2020P002274). Las muestras de suero de los receptores de la vacuna que recibieron una o dos dosis de la vacuna BNT162b2 o mRNA-1273 se recolectaron en tubos con tapa roja. Para cada individuo, se obtuvo información demográfica básica, incluida la edad y el sexo, así como cualquier historial relevante de COVID-19.

Líneas celulares. Se cultivaron células HEK 293T (ATCC) en DMEM (Corning) que contenía suero bovino fetal al 10% (VWR) y penicilina. / estreptomicina (Corning) a 37 ° C / CO2 al 5%. Las células 293T-ACE2 fueron un regalo de Michael Farzan (Scripps Florida) y Nir Hacohen (Broad Institute) y se cultivaron en las mismas condiciones. La confirmación de la expresión de ACE2 en células 293T-ACE2 se realizó mediante citometría de flujo.

DETALLES DEL MÉTODO.

Construcción de plásmidos de expresión de picos variantes. Para crear plásmidos de expresión de picos variantes, realizamos múltiples fragmentos de PCR

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utilizando oligonucleótidos que contienen cada mutación deseada (tecnología de ADN integrada) y utilizamos el ensamblaje de fragmentos superpuestos para generar el complemento completo de mutaciones para cada cepa. Es importante destacar que generamos estas mutaciones en el contexto de nuestro plásmido de expresión de pico de SARS-CoV-2 con codón optimizado previamente descrito que alberga una deleción de los 18 aminoácidos C-terminales que previamente demostramos que dan como resultado títulos de pseudovirus más altos. Los fragmentos ensamblados se insertaron en el vector pTwist-CMV-BetaGlobin-WPRE-Neo digerido con NotI / XbaI utilizando el kit de clonación In-Fusion HD (Takara). Todo el ADN plasmídico resultante utilizado en el estudio se verificó mediante secuenciación profunda de plásmido completo (Illumina) para confirmar la presencia de solo las mutaciones previstas.

Ensayo de neutralización de pseudovirus SARS-CoV-2. Para comparar la actividad neutralizante de los sueros vacunados contra los coronavirus, producimos partículas lentivirales pseudotipadas con diferentes proteínas de pico como se describió anteriormente (García-Beltrán et al. 2021). Brevemente, se produjeron pseudovirus en células 293T mediante transfección con PEI de un esqueleto lentiviral que codifica CMV-Luciferasa-IRES-ZsGreen así como plásmidos auxiliares lentivirales y cada plásmido de expresión de variante de pico. Después de la recolección y el filtrado, la producción se cuantificó titulando mediante citometría de flujo en células 293T-ACE2. Los ensayos de neutralización y la lectura se realizaron en un manipulador de líquidos Fluent Automated Workstation (Tecan) utilizando placas de 384 pocillos (Grenier). Se realizaron diluciones seriadas triples de 1:12 a 1: 8,748 para cada muestra de suero antes de agregar 50–250 unidades infecciosas de pseudovirus durante 1 h. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo células 293T-ACE2 que contenían polibreno y se incubaron a 37ºC / CO2 al 5% durante 60-72 h. Después de la transducción, las células se lisaron usando un tampón que contenía luciferina (Siebring-van Olst et al. 2013) y se agitaron durante 5 min antes de la cuantificación de la expresión de luciferasa dentro de 1 h de la adición del tampón usando un luminómetro Spectramax L (Molecular Devices). El porcentaje de neutralización se determinó restando la luminiscencia de fondo medida en los pocillos de control celular (solo células) de los pocillos de muestra y dividiendo por los pocillos de control de virus (solo virus y células). Los datos se analizaron usando Graphpad Prism y los valores de pNT50 se calcularon tomando la inversa del valor de concentración inhibitoria del 50% para todas las muestras con un valor de neutralización de pseudovirus del 80% o más a la concentración más alta de suero.

Titulación de pseudovirus. Para determinar las unidades infecciosas de vectores lentivirales pseudotipados, se sembraron 400.000 células 293T-ACE2 por pocillo de una placa de 12 pocillos. 24 h más tarde, se hicieron tres diluciones seriadas de diez veces de sobrenadante puro de pseudovirus en 100 μL, que luego se utilizaron para reemplazar 100 μL de

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medio en las células en placa. Las células se incubaron durante 48 ha 37ºC / 5% de CO2 para permitir la expresión del gen indicador ZsGreen y se recolectaron con tripsina-EDTA (Corning). Las células se resuspendieron en PBS suplementado con FBS al 2% (PBS +) y se analizaron en un citómetro de flujo Stratedigm S1300Exi para determinar el porcentaje de células que expresan ZsGreen. Las unidades infecciosas se calcularon determinando el porcentaje de células infectadas en los pocillos que presentaban disminuciones lineales en la transducción y multiplicando por el número medio de células por pocillo determinado al inicio del ensayo. A MOI baja, se supuso que cada célula ZsGreen transducida representaba una única unidad infecciosa.

Evaluación citométrica de flujo de la expresión del pico. Para comparar la expresión superficial relativa de las proteínas variantes del pico de pseudovirus, se sembraron 400.000 células 293T por pocillo de una placa de 12 pocillos. 24 h más tarde, 1 μg de plásmido de expresión de pico variante y transfectado usando PEI. Las células se incubaron durante 48 ha 37 ° C y se recolectaron en PBS +. Las células transfectadas con cada vector se dividieron y se tiñeron con 5 μg / ml de S309, ADI-55689 o ADI-56046 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con 1 ml de PBS +, se centrifugaron a 900 x gy se tiñeron con 2 µg / ml de anticuerpo policlonal anti-IgG-AF647 humana (Invitrogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron con 1 mL de PBS +, se centrifugaron a 900 x g, se resuspendieron en 100 μL de PBS +, se fijaron con 100 μL de PFA al 4% y se analizaron en un citómetro de flujo Stratedigm S1300Exi.

ELISA de anticuerpos totales del dominio de unión al receptor de SARS-CoV-2. La detección cuantitativa de anticuerpos totales al dominio de unión al receptor de SARS-CoV-2 (RBD) se realizó como se describió previamente (García-Beltran et al. 2021). Brevemente, utilizamos un ELISA indirecto con un estándar que consta de anticuerpo monoclonal anti-SARS-CoV y -CoV-2 (CR3022) (isotipo IgG1). Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos con RBD de SARS-CoV-2 de tipo salvaje purificado. Las placas se bloquearon con BSA y se lavaron. Se creó una curva estándar de siete puntos utilizando CR3022-IgG1 a partir de 2 μg / ml realizando diluciones en serie 1: 3 con tampón de dilución, y las muestras de suero se diluyeron 1: 100 con tampón de dilución. Las muestras diluidas y los estándares se agregaron a los pocillos correspondientes y se incubaron durante 1 ha 37 ° C, seguido de lavado. Los anticuerpos totales se detectaron con anti-IgG humana + IgA + IgM (H + L) -HRP (Betil) diluido 1: 25.000 para una incubación de 30 min a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadió sustrato TMB (Inova) a cada pocillo y se incubó durante 5-15 min antes de detenerlo con H2SO4 1 M. La densidad óptica (O.D.) se midió a 450 nm con la resta del O.D. a 570 nm como longitud de onda de referencia en un lector de microplacas SpectraMax ABS. Los niveles de anticuerpos anti-RBD se calcularon interpolando

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sobre la curva estándar y corrigiendo la dilución de la muestra; una unidad por mL (U / mL) se definió como la reactividad equivalente observada por 1 μg / mL de CR3022. En los ensayos en los que se usó RBD mutado que albergaba mutaciones K417N, E484K y N501Y, se realizó exactamente el mismo protocolo ELISA después de confirmar que nuestro estándar (CR3022-IgG1) se unía al RBD mutante frente al de tipo salvaje de forma casi idéntica.

CUANTIFICACIÓN Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO. Los datos y los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 9.0.1, JMP Pro 15.0.0 (SAS Institute) y R v4.0.2. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando FlowJo 10.7.1. Se realizaron ANOVA multivariados no paramétricos en las cifras indicadas donde estaban presentes varias cohortes; todos los valores de p se ajustaron para múltiples comparaciones. La significancia estadística se definió como p <0.05. Las barras de error en todas las cifras representan una desviación estándar. Los análisis de interacción / regresión se realizaron utilizando el paquete lm en R, utilizando estimaciones de pNT50 (normalizadas a tipo salvaje) para cada suero de donante y permitiendo la interacción entre las estimaciones de neutralización para cada variante de RBD de tipo salvaje (v1 / wtRBD, v2 / wtRBD, o v3 / wtRBD) y la variante que contiene solo mutaciones K417N + E484K + N501Y para explicar la neutralización compuesta de B.1351 v1, v2 y v3.

P25 hasta P28

Son las referencias. Favor descargar el archivo original en inglés. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013

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ASPECTOS DESTACADOS.

● Han surgido a nivel mundial numerosas variantes de SRAS-CoV-2 que albergan mutaciones en pico ● Las vacunas de ARNm provocan una potente actividad neutralizante contra pseudovirus homólogos ● La neutralización cruzada de cepas con mutaciones en el dominio de unión al receptor (RBD) es deficiente ● Tanto RBD como no RBD las mutaciones median el escape de la inmunidad humoral inducida por la vacuna.

EN RESUMEN. Los análisis de suero de individuos vacunados con una o dos dosis de vacunas de ARNm contra 10 variantes circulantes de SARS-CoV-2, muestran que P.1 y B.1.351 en particular exhiben una neutralización limitada por inmunidad humoral inducida por la vacuna. Se encontró que este escape estaba mediado en gran parte por mutaciones en el dominio de unión al receptor del pico de SARS-CoV-2.

P30 a la P34

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https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.013